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肿瘤患者红细胞免疫功能与SAPO-1/Fas、TNF-α、NO表达水平的实验研究           ★★★ 【字体：小 大】
肿瘤患者红细胞免疫功能与SAPO-1/Fas、TNF-α、NO表达水平的实验研究
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-1    
作者：王广兰,曹阳,张长远,郭同生,徐万青
【关键词】  肿瘤
　　【摘要】  目的  探讨肿瘤患者红细胞免疫功能与SAPO-1/Fas、TNF-α、NO表达水平的相关性及相互作用。方法  采用酵母菌-红细胞免疫黏附试验，对45例化疗前和17例化疗后病情缓解者进行了红细胞C3b受体花环试验（RBC-C3bRR）和红细胞免疫复合物花环试验（RBC-ICR）及ELISA法对107例肿瘤患者及22例健康人进行了SAPO-1/Fas的检测，其中部分进行了TNF-α、NO检测。结果  肿瘤患者血清SAPO-1/Fas表达水平明显高于健康对照组（P<0.001），且与肿瘤种类无关；17例化疗后病情缓解者SAPO-1/Fas表达水平比化疗前显著降低(P<0.05)。45例和17例肿瘤患者血清同时检测SAPO-1/Fas、TNF-α表达水平及SAPO-1/Fas、NO含量并进行单因素直线相关分析，分别为r=0.76，P<0.05，r=0.72，P<0.05，呈显著正相关。RBC-C3bRR明显降低，45例肿瘤患者化疗前又明显低于17例病情缓解者(P<0.01)，RBC-ICR明显高于健康人，45例化疗前肿瘤患者RBC-ICR明显高于17例化疗后病情缓解者(P<0.01)。结论  肿瘤患者RBC-ICR和SAPO-1/Fas、TNF-α、NO表达水平明显增高，呈显著正相关，RBC-C3bRR明显降低。为研究红细胞免疫与淋巴细胞免疫的相互关系及肿瘤治疗提供了新的理论基础和实验依据。
   
　　【关键词】  肿瘤；SAPO-1/Fas；红细胞免疫；1型补体受体
   
　　细胞凋亡（apoptosis，APO）和红细胞免疫系统是机体清除感染、变异、衰老的细胞，维持自身正常生理平衡的一种调节方式；同时肿瘤细胞及其相关抗原可能直接旁路激活补体，吸引红细胞（RBC） 1 型补体受体（CR1）免疫黏附肿瘤细胞和相关抗原，并将它们运输至肝脾网状内皮系统，由巨噬细胞销毁［1］。近年来，研究发现APO-1与其配体（FasL）通常被认为是致死基因，因为他们的相互作用往往导致表达APO-1的细胞发生APO而受到人们的广泛关注。有研究报道［2］，人类许多恶性肿瘤表现为APO功能下降。在肿瘤患者免疫活性细胞如致敏T淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK）等通过Fas系统活化介导细胞毒作用，以凋亡方式清除肿瘤细胞。免疫活性细胞通过其表面的FasL结合表达Fas的靶细胞，从而使其凋亡，而APO-1可与FasL结合，阻碍了靶细胞凋亡。同时一氧化氮（NO）含量超量也可引起基因突变和诱发肿瘤。本研究采用酵母菌-红细胞免疫黏附试验进行了红细胞C3b受体花环试验（RBC-C3bRR）和红细胞免疫复合物花环试验（RBC-ICR）［3］及ELISA法测定SAPO-1/Fas分子，并对NO含量和肿瘤坏死因子（TNF-α）的相关性进行了分析研究。现将结果报告如下。
　　1  材料与方法
　　1.1  研究对象  107例肿瘤患者，男80例，女27例，平均年龄55.48岁，患者均为我院1999～2004年经临床和实验检查确诊的住院患者。22例健康对照组血清来自健康体检人群，男18例，女4例，平均年龄22.27岁。
　　1.2  材料
　　1.2.1  标本收集  所有血样均采自晨间空腹血，部分患者于化疗前后分别采血。常温下3000r/min离心10min，血清于-20℃保存（同时取肝素抗凝血1ml用于红细胞免疫黏附试验）。
　　1.2.2  人SAPO-1/Fas检测  以抗人SAPO-1/Fas单抗预包被酶联试剂盒，美国Genxyme公司，购自品美生物工程有限公司，按说明书操作。
　　1.2.3  血清TNF-α检测  以双抗夹心ELISA法，购自邦定公司，按说明书操作（自行包被）。
　　1.2.4  血清NO含量的检测  以硝酸还原酶法测定血清NO3/NO2代表NO浓度。购自南京建成生物工程研究所，采用荷兰生产RS-232型半自动生化分析仪测定。
　　1.2.5  材料来源  冻干补体致敏酵母菌与未致敏酵母菌（由上海长海医院免疫室提供）。
　　1.3  方法
　　1.3.1  准备1  取肝素抗凝血1ml，用生理盐水洗涤3次，每次2000r/min离心3～5min，做细胞计数并配制成1.25×107/ml应用液备用。
　　1.3.2  准备2  取补体致敏及未致敏酵母菌多糖冻干试剂各1支，按要求溶解，分别用生理盐水洗涤离心2次（2000r/min，4min），计数红细胞并配成1×108/ml应用液备用。
　　1.3.3  操作  取2支试管，每管加入红细胞应用液0.05ml。第一管再加入补体致敏酵母菌多糖液0.05ml，第二管再加入未致敏酵母菌多糖液0.05ml，摇均，放37℃水浴30min。取出用手轻轻摇均，每管各加0.1ml生理盐水，混匀后再各加0.25％戊二醛0.025ml，轻轻混匀，取1/3量，水平涂片，吹干，甲醇固定，瑞氏染色，湿片在高倍镜下计数。1个红细胞结上2个或2个以上酵母菌为1个花环。计数200个红细胞计算出百分率。第一管为RBC-C3bRR，第二管为RBC-ICR。
　　2  结果
　　2.1  肿瘤患者与健康对照组血清SAPO-1/Fas表达水平及NO含量比较  见表1。结果显示，肿瘤患者血清SAPO-1/Fas表达水平及NO含量明显高于健康对照组，并且与肿瘤的种类无关。
　　表1  肿瘤患者与健康对照组人血清SAPO-1/Fas表达水平及NO含量比  （略）
　　注：各种肿瘤之间比较P＞0.05；与对照组比较，P均＜0.001
　　2.2  肿瘤患者化疗前后SAPO-1/Fas水平变化  在接受化疗前后分别测SAPO-1/Fas水平的患者中，化疗后病情缓解17例，化疗前的表达水平为(8.15±0.11)ng/ml，化疗后的表达水平为(7.05±0.59)ng/ml，进行配对资料t检验，P＜0.05。提示SAPO-1/Fas水平随病情缓解显著降低。因化疗后部分病情进展者例数少，未予统计。
　　2.3  肿瘤患者与健康对照组TNF-α水平比较  45例肿瘤患者血清TNF-α水平(6.26±1.74)ng/ml，较健康对照组（22例）的(2.04±0.51)ng/ml显著升高（P＜0.05）。肿瘤化疗后患者血清TNF-α水平呈下降趋势，与肿瘤组比较差别无显著性（P＞0.05）。
　2.4  肿瘤患者血清SAPO-1/Fas与TNF-α、NO含量的相关性  将45例肿瘤患者同时测定的SAPO-1/Fas与TNF-α血清水平及17例肿瘤患者同时测定SAPO-1/Fas与NO含量进行单因素直线相关分析，分别为r=0.76,P＜0.05,r=0.72,P＜0.05。结果显示：肿瘤患者血清SAPO-1/Fas与TNF-α、NO呈显著正相关。
　　2.5  肿瘤患者化疗前后与健康人红细胞CR1活性与携带IC含量变化比较  45例肿瘤患者化疗前较健康对照组RBC-C3bRR明显降低，而又明显低于17例病情缓解患者，差异有非常显著性（P＜0.01），而17例化疗后病情缓解者和45例化疗前肿瘤患者的RBC-ICR明显高于健康对照组，45例化疗前肿瘤患者RBC-ICR亦明显高于17例化疗后病情缓解者，其比较差异均有非常显著性（P＜0.01），见表2。
　　表2  健康对照组与化疗前肿瘤患者及化疗后病情缓解者结果比较  （略）
　　注：与健康对照组比较，*P＜0.01
　　3  讨论
　　Fas抗原又名APO-1，CD95，是细胞膜表面的一种凋亡相关分子，是一种由319个氨基酸组成的 Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于TNF和神经生长因子（NGF）受体家庭成员。主要以膜受体的（mFas）形成存在，也可出现可溶性APO-1（SAPO-1/Fas）分子。近年来研究发现SAPO-1/Fas及红细胞CR1在调节免疫功能维持体内环境的平衡方面起着重要作用。资料显示：SAPO-1/Fas和红细胞免疫物质与肿瘤的发生、发展有着密切的关系［4，5］。Fas基因位于人第10号及小鼠第19号染色体，Fas抗原为FasL的受体效应细胞，FasL与靶细胞Fas结合时，可诱导靶细胞凋亡；而FasL与Fas结合，又可以控制这些靶细胞的凋亡。Cheng等研究发现一种突变的人Fas基因，可编码产生一种SAPO-1。由于突变基因mRNA缺乏编码Fas分子跨膜结构区时，以SAPO-1/Fas的第6外显子，阻断了凋亡信号的传导，导致体内自身反应T、B细胞的异常积聚。以同样水平的该SAPO-1/Fas分子注射小鼠体内时，可观察到明显的T细胞凋亡受抑［6～8］。本实验结果显示：肿瘤患者的SAPO-1/Fas水平上升，可竞争性抑制FasL与Fas的相互作用，造成Fas介导的APO减少；适量的TNF-α、NO对机体的保护反应是必须的，但是，过量的TNF-α、NO对机体产生损伤反应。近年来，许多学者发现TNF－a不但可以引起实体瘤发生出血性和缺血性坏死，还具有促进某些细胞生长的作用［9］。体外研究发现，TNF能够使白血病细胞增殖，其作用机制是TNF作为APO的促发因子诱导APO。因此，SAPO-1/Fas与TNF-α、NO、RBC-C3bRR、RBC-ICR的改变与免疫系统紊乱和肿瘤的发生、发展有着密切的关系；对肿瘤患者的病情进展和转归具有重要的参考价值；也为解释肿瘤细胞逃避免疫监视及白血病的发生提供一个可能的机制。本研究尚发现肿瘤患者NO含量显著增高，并与SAPO-1/Fas呈正相关。
　　红细胞免疫是机体免疫的一个重要的组成部分，与免疫系统内其他细胞的功能存在一定相关性，RBC CR1具有免疫黏附C3b等的能力，其活性的测定可作为评价RBC免疫黏附功能强弱的主要指标。自1981年Siegel提出了红细胞免疫系统至今，研究发展迅速，大量研究表明红细胞免疫参与肿瘤的发生发展过程。肿瘤患者的RBC CR1分子明显减少时，可能与肿瘤细胞释放抑制物，影响RBC CR1数量与活性，以及RBC CR1基因缺陷有关；如果RBC CR1清除循环免疫复合物（CIC）能力下降，必然使CIC含量增加，封闭淋巴细胞功能，使机体抗肿瘤特异免疫功能受损；RBC CR1天然免疫黏附活性下降，RBC不能及时将进入血循环中的癌细胞和致病原运至肝脾网状内皮系统销毁，使癌细胞容易血行转移，而且可使致癌因子各种抗原存留血循环和病灶局部时间延长，更易激活B淋巴细胞，产生更多封闭抗体和自身抗体，肿瘤患者往往在血循环中含有自身抗体，血清出现封闭抗体、CIC抑制肿瘤的适应性免疫反应和天然免疫炎症的发生，可能与此有关［1］。本研究结果显示：肿瘤患者RBC-C3b受体活性明显降低，RBC-ICR明显增高，与正常人比较差异有非常显著性（P<0.01）；化疗前肿瘤患者RBC-C3bRR明显低于化疗后病情缓解者，其RBC-ICR化疗前肿瘤患者明显高于化疗后病情缓解者，差异均有非常显著性P＜0.01）。证实了肿瘤患者化疗前后的病情发展过程中，RBC-C3bRR和RBC-ICR有显著变化。由于肿瘤患者产生大量的IC，占据RBC膜上的C3b受体空位或破坏其受体，使RBC-C3b受体下降及活性降低，IC明显增高。这种现象对肿瘤患者化疗前后及病程观察有重要参考价值。本研究对肿瘤患者的SAPO-1/Fas表达及TNF-α、NO含量和红细胞免疫相关性及相互作用进行探讨，结果反映了红细胞免疫与SAPO-1/Fas表达及TNF-α、NO血浆中的水平和RBC-ICR明显增高，可抑制SAPO-1/Fas介导的APO使肿瘤细胞凋亡减少，说明在肿瘤细胞发展过程中可能起着非常重要的作用，因此用于肿瘤患者的研究，通过合适而有效的途径使用外源性的FasL与肿瘤细胞上的SAPO-1/Fas结合能起到杀伤肿瘤细胞的作用，增加肿瘤细胞APO。这将有可能成为恶性肿瘤治疗新的行之有效的方法，也为研究RBC免疫与淋巴细胞免疫的相互关系及肿瘤治疗提供了新的理论基础和实验依据。
　　【参考文献】
　　1  郭峰，张乐元，许育，等.原发性肝癌患者红细胞免疫分子CR1活性和循环免疫复合物的变化.第二军医大学学报研究简报，2004，7.
　　2  Wyllie  AH. Apoptosis  and  regulation  of   cell  numbers  in  normal  and  neoplastic tissues. Cancer  Metastasis  Rev，1992，11(2):95-103.
　　3  郭峰.红细胞免疫功能的初步研究.中华医学杂志，1982，62（12）：175.
　　4  Murakami  M,  Sasaki  T,   Miyata   H,  et  al. Fas  and  fas ligand: expression  and  soluble  circulating  lerels  in  bile  duct  carcinoma.  Oncol  Rep,2004,11(6):1183-1186.
　　5&nbsp; 郭峰，路永珍.红细胞免疫学新探（上卷）.南京：南京大学出版社，1993，1-171.
　　6  Cheng  JH. Characterization  of  human  fas  gene:exon/intron  organization  and  promoter region. Immunol,1995,154:1239-1245.
　　7  乐军.Fas抗原分子.国外医学・临床生物化学与检验学分册，1996，5（17）：206-208.
　　8  王广兰,曹阳,郭桐生,等.肿瘤患者血清TNF-α、SAPO-1/Fas测定及意义.中国肿瘤临床与健康，2000，6(7)：15-16.
　　9  梁实.肿瘤坏死因子的另一面：促进某些白血病细胞生长的作用.国外医学・肿瘤学分册，1994，6：334.
长远,郭同生,徐万
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