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清热通下中药对胆管炎大鼠肠屏障保护 和炎症反应调控的研究           ★★★ 【字体：小 大】
清热通下中药对胆管炎大鼠肠屏障保护 和炎症反应调控的研究
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-1    
【关键词】  清热通下中药
    ［摘要］  目的：探讨清热通下中药在急性胆管炎治疗中对肠黏膜屏障保护和炎症调控的作用。方法：60只SD大鼠分为3组，每组20只。模型组（A组）制作急性胆管炎模型；治疗组（B组）制作急性胆管炎模型并喂清热通下中药治疗；假手术组（C组）仅剖腹后缝合。取血检测细胞因子、炎症介质、内毒素和细菌移位等指标。结果：A组白细胞介素6（interleukin6, IL6）、白细胞介素8（interleukin8, IL8）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα, TNFα）、血清C反应蛋白(C reactive protein, CRP)和一氧化氮(nitric oxide, NO)明显高于B组和C组（P<0.01），IL2则显著低于B组和C组（P<0.01）；A组的血清内毒素和肝、脾、肠系膜淋巴结细菌移位数显著高于B组和C组（P<0.01）。结论：具有清热通下作用的中药在治疗急性胆道感染中具有保护肠黏膜屏障、降低血清内毒素和调节机体炎症反应的作用。
    ［关键词］  清热通下中药; 胆管炎; 细胞因子; 炎症介质
     Impact of antipyretic and purgative herbs on intestinal mucosal barrier and inflammatory response in treatment of acute cholangitis in rats
       ABSTRACT  Objective: To investigate the effects of antipyretic and purgative herbs on intestinal mucosal barrier and inflammatory response in the treatment of acute cholangitis. Methods: Sixty SD rats were randomly divided into group A (untreated group, acute cholangitis was induced, n=20), group B (treatment group, acute cholangitis was induced and treated with antipyretic and purgative herbs, n=20) and group C (sham operation group, n=20). At the third or fifth day after operation, the rats were sacrificed and sampled. The serum endotoxin, cytokines and inflammatory mediators were tested and the numbers of labeled bacteria in the liver, spleen and mesenteric lymph nodes translocated from the gut were assayed. Results: As compared with group A, the serum content of endotoxin, IL6, IL8, TNFα, CRP and NO was significantly lower and that of IL2 was significantly higher, and the translocated numbers of labeled bacteria from gut were reduced in both group B and group C（P<0.01）. Conclusion: Antipyretic and purgative herbs can play therapeutic roles in the treatment of acute biliary tract infections, including the protection of intestinal mucosal barrier from bacterial translocation, reduction of serum endotoxin content and regulation of inflammatory response.
    KEY WORDS  antipyretic and purgative herbs; cholangitis; cytokines; inflammatory mediators
     近年，随着对重症感染研究的不断深入，国内外学者更加注重保护机体防御功能和调节机体适度炎症反应在抗感染治疗中的地位。稳定和保护机体天然屏障以及调控炎症时机体体液性因子与细胞因子的平衡，正成为提高外科重症感染治疗效果的重要研究方向。急性胆管炎是外科常见和危重感染性疾病，迄今为止，手术和抗生素疗法是治疗这一疾病的主要手段，其病死率和病残率还很高。以往中西医结合治疗急性胆道感染的临床实践已经显示，清热通下中药具有较为理想的疗效，尤其在缓解症状、减少并发症和加速康复等方面作用显著［1］。中医中药在治疗急性胆道感染中的独特作用正引起临床上广泛关注。本研究旨在探讨清热通下中药在胆道感染时对机体肠黏膜防御屏障和全身炎症反应的干预作用。
    1  材料与方法
    1.1  实验动物与分组  选择SD大鼠60只，雌雄各半，体质量225～245 g，随机分为3组，每组20只(上海中医药大学实验动物中心提供，纯系清洁级动物)。模型组（A组）大鼠参照龚建平等［2］的方法，将胆总管结扎，同时向胆总管内注入致病性大肠杆菌，制作大鼠急性胆道感染模型，手术后喂生理盐水。清热通下中药治疗组(B组)大鼠同上造模，手术后喂清热通下中药锦红片悬液。假手术组（C组）大鼠剖腹后缝合，手术后喂生理盐水。
    1.2  实验材料
    1.2.1  药物  锦红片系已故中医名家顾伯华教授和著名中西医结合外科专家徐长生教授的经验方，主要成分为红藤、蒲公英、生大黄。由上海中药制药一厂提供锦红片干粉，以蒸馏水配成含干粉110 mg/ml的悬混液，用于动物灌胃。
    1.2.2  标记细菌&nbsp; 由上海卫生防疫站提供菌株，菌株置于肉汤培养基中培养并配制成菌液。大肠杆菌O111B4(菌液浓度5×109 cfu/ml)用于实验动物胆总管内注入，制作急性胆道感染模型。大肠杆菌O55B5(菌液浓度5×109 cfu/ml)用于实验动物灌胃，作为标记菌检测肠道细菌移位数。
    1.2.3  试剂与仪器  鲎试剂内毒素定量检测试剂盒，上海市医学化验所提供；灭菌肉汤琼脂培养基，FMG182放射线免疫γ计数器，上海中医药大学龙华医院中心实验室提供；CPS2型超声粉碎机，上海超声波仪器厂生产；－85℃超低温冰箱，美国Harris公司产品；LXJⅡ型离心沉淀机，上海医用分析仪器厂生产；免疫化学定量仪，美国Beckman公司产品；一氧化氮(nitric oxide, NO)试剂盒，南京建成生物工程研究所提供；白细胞介素6（interleukin6, IL6）、白细胞介素8（interleukin8, IL8）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα, TNFα）放射免疫分析测定盒，北京北方生物技术研究所提供；ELISA试剂盒，深圳晶美生物工程有限公司提供。
    1.3  实验方法
    1.3.1  造模方法  动物以戊巴比妥钠25 mg/kg腹腔注射麻醉，腹部备皮，以新洁尔灭酊消毒皮肤，无菌条件下进入腹腔，游离胆总管，双重结扎胆总管，向胆总管近端内注入大肠杆菌O111B4 1 ml/kg，缝合创口。假手术动物同样在无菌条件下打开并缝合腹腔，但不结扎胆总管，也不予标记菌注入。实验动物分别于手术后第3和第5天处死取材，于取材前24 h予大肠杆菌O55B5 7 ml/kg灌胃。
    1.3.2  给药方法  模型组大鼠造模后每天以生理盐水10 ml/kg灌胃2次。中药组大鼠造模前1天予锦红片悬液10 ml/kg灌胃1次，造模当天以相同剂量锦红片悬液灌胃1次，并于灌胃后4 h造模，方法同模型组。造模后每天以相同剂量锦红片悬液灌胃2次。假手术组大鼠手术后每天以生理盐水10 ml/kg灌胃2次。
    1.3.3  取材方法  各组动物均以戊巴比妥钠25 mg/kg腹腔注射麻醉，再次在无菌条件下进入腹腔，于后腔静脉处抽取血标本，用于血清内毒素、细胞因子和炎症介质等检测；取肝、脾、回肠及盲肠肠系膜等组织供标记细菌移位检测。
    1.4  检测指标
    1.4.1  细胞因子检测  血清IL2测定采用ELISA法，根据ELISA试剂盒说明步骤操作测定。血清IL6、IL8和TNFα采用放射免疫分析法测定，根据各自的放射免疫分析测定盒说明的步骤检测。
    1.4.2  炎症介质  血清C反应蛋白(C reactive protein, CRP)采用Beckman免疫化学定量仪自动测定，NO采用硝酸还原酶法测定。
    1.4.3  血清内毒素测定  采用鲎试剂定量测定各组动物血清内毒素含量。
    1.4.4  标记菌检测  取各组动物的肝、脾、回肠及盲肠肠系膜(其中含有肠系膜淋巴结)，称重后分别加10倍重生理盐水稀释，置于超声匀浆机中制成10%组织匀浆，各取0.1 ml置于肉汤培养基培养24 h，统计标记大肠杆菌O55B5菌落数。
    1.5  统计学方法  实验数据应用SPSS统计软件进行单因素方差分析。
 2  结  果
    2.1  细胞因子  实验第3天C组IL2含量显著高于其他两组，A组最低（P<0.01），见表1。至第5天时，各组IL2均有下降趋势，但B组仍显著高于A组（P<0.01），见表2。实验第3天A组TNFα、IL6、IL8含量显著高于其他两组，以C组最低（P<0.01或P<0.05），见表1。至实验第5天，各组TNFα、IL6均有所下降，但B组仍显著低于A组（P<0.01）；而实验第5天，A、B组IL8仍维持较高水平，但B组仍显著低于A组（P<0.05），见表2。
    2.2  炎症介质  实验第3天A组和B组动物血清CRP含量明显高于C组（P<0.01），其中A组尤为明显，B组与A组之间比较也有明显差异(P<0.05)，见表3；第5天A组和B组CRP含量均有降低，以B组下降幅度更明显（P<0.01），见表4。实验第3天A、B两组动物血清NO含量明显高于C组（P<0.01），其中A组最高，B组与A组之间比较有显著性差异(P<0.05)，见表3；第5天A、B两组的NO仍处于高值水平，与C组比较差异显著，而A、B两组间无明显差异，见表4。 表1  第3天各组动物血清细胞因子含量表2  第5天各组动物血清细胞因子含量表3  第3天各组动物血清炎症介质含量表4  第5天各组动物血清炎症介质含量
    2.3  细菌内毒素检测  B组动物血清内毒素含量明显低于A组，经统计学处理，两组有显著差异(P <0.01)；B组与C组相比无显著差异(P>0.05)。见表5。
    2.4  标记细菌移位  3组实验动物的肝、脾、肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node, MLN)中均发现有标记细菌的移位，但C组细菌移位数明显低于A、B组(P<0.01)，提示胆道感染的发生对肠道黏膜屏障的影响较大。B组细菌移位数明显低于A组，两组在统计学上有显著差异(P<0.01),见表6表5  第3天各组动物血清内毒素含量表6  第3天各组动物肝、脾、肠系膜淋巴结细菌移位检测结果
    3  讨  论
    3.1  “清热通下”治疗急性胆道感染的理论基础  急性胆管炎是外科炎性急腹症中常见的危重疾病，发病率随着胆石病的高发生率而不断升高，严重威胁广大人民的健康。研究表明，急性胆道感染时，细菌及其产生的毒素和病损的自身组织作为抗原性炎症刺激物激活巨噬细胞等炎症细胞释放细胞因子，触发炎症介质瀑布样级联反应，表现出以炎症反应增强为代表的过度炎症反应。同时，疾病造成的机体天然防御屏障的损害又会进一步加重这种炎症反应，干扰机体的免疫平衡，影响疾病的恢复和预后。尽管抗生素治疗是目前非手术治疗急性胆道感染的主要手段，但抗生素在机体屏障功能的保护和炎症反应的调控方面缺乏有效作用，这恰好又是近年国内外学者在重症感染治疗中特别注重的研究方向。
    急性胆管炎在中医学中虽无明确病名，但有关类似症状的记载，散见于“结胸”、“黄疸”、“腹痛”、“胆胀”、“胁痛”等证的叙述中。中医学认为急性胆道感染的病因病机，主要为肝胆气滞、疏泄失常，邪热蕴阻、横逆脾土，湿热蕴结、热结不散。“胆腑不通”、“不通则痛”是本病的基本病理改变。急性胆道感染的早、中期临床征象在中医辨证中属里热实证，病变发展迅速，一旦治疗不当或不及时，即可因热腐成脓、热毒炽盛扩入营血而导致亡阴、亡阳等危重证象。这种邪正交争的过程，尤其是肝胆湿热交蒸，热胜肉腐演变至热毒嚣张，火毒逆传心包（营血），出现热深厥深的过程，酷似西医现今认识的全身性炎症反应综合征多器官功能障碍综合征多器官功能衰竭之过程。在急性胆道感染的早、中期采用清热通下之法荡涤实结，清泄郁热，使邪外出，是控制该病转归之关键，符合中医“六腑以通为用”的原则。本次研究结果显示，清热通下中药对急性胆管炎大鼠的肠黏膜屏障和全身炎症反应具有一定的干预作用。
    3.2  “清热通下”保护肠黏膜屏障和抗内毒素  胆道梗阻时肠道内胆盐缺乏，同时胆汁中富含的SIgA不能进入肠道， 加上肠道内革兰氏阴性杆菌的优势繁殖，极易导致细菌移位和内毒素血症的发生［2，3］。本研究发现急性胆管炎动物细菌移位数显著高于对照组，证明急性胆道感染可损害肠黏膜屏障而促进细菌移位的发生。实验还发现急性胆道感染动物在出现细菌移位的同时，其血浆内毒素含量也明显增高。而经清热通下中药治疗的动物其肠道细菌移位数和血浆内毒素含量明显下降，提示“清热通下”在机体胆管炎病理状态下具有保护肠黏膜屏障从而减少细菌移位的作用。从这类中药的相关研究资料来看［4~6］，中药通过“通下”这一功效能使肠蠕动增加，荡涤胃肠道积滞，使肠道内细菌和内毒素随肠内容物排出体外，从而减少细菌移位并降低内毒素的吸收。同样，中药也可能通过“清热”这一功效抑制肠道细菌生长，中和内毒素以及抗炎等，发挥保护肠屏障，减少细菌移位和降低内毒素的作用。
    3.3  “清热通下”调节免疫和调控炎症反应  国内外研究发现，体液性炎症介质和细胞因子的变动，反映了机体在感染和应激情况下的免疫和炎症状态。这类物质如不能维持抗炎和促炎的适度与动态平衡，将导致病变的恶化［7］。
    细胞因子IL2的主要生物学效应是促进T细胞生长及其他细胞因子的产生，促进自然杀伤细胞的生长分化和B细胞的增殖与抗体的合成。严重创伤或感染患者常因IL2生成减少而导致细胞免疫功能低下［8］。本实验第3天时C组IL2明显高于其他各组，其中A组降低最为显著，也提示了这种变化。而B组在同样感染的情况下，IL2明显高于A组，说明“清热通下”有助于调节免疫功能和减轻胆道感染时的急性炎症反应。细胞因子IL6可刺激活化B细胞增殖及其免疫球蛋白的转录和生成，是一内源性致热源，能刺激肝细胞产生一系列的急性相蛋白，同时协调IL1促进B细胞分化和抗体产生，促进急性期反应，是最重要的致炎性细胞因子。本实验发现，第3天时A组IL6的含量明显高于其他组，B组与A组间有显著性差异，提示“清热通下”能显著减轻急性胆道感染时IL6对机体的影响。细胞因子IL8作为重要的炎症介质参与免疫、代谢和炎症急性期反应的调节，增强机体抗感染的能力，但过多分泌则可损害正常细胞和组织。本实验第3天，A组IL8的含量明显高于其他各组，提示其炎症反应最重。B组则相对较低，说明“清热通下”对急性胆道感染时的炎症有调控作用。第5天时A组IL8数值稍降，B组反而轻度升高，提示中药可能对IL8的影响较稳定。细胞因子TNFα低浓度时是防御病原微生物的重要因素，浓度过高时则导致一系列炎性损害。本实验中A组TNFα含量明显高于其他组，而B组则相对较低，说明“清热通下”在急性胆道感染时对TNFα的影响与干预IL8相似。
    CRP是急性炎症状态下血液中最常见的一种非抗体性蛋白质。本次研究发现，急性胆道感染动物CRP增加十分显著，达正常的数百倍。CRP的增加程度在一定范围内与机体炎症反应程度成正相关，用“清热通下”治疗的动物，则CRP显著降低。说明“清热通下”能缓解急性胆道感染时的过度炎症反应。NO作为一种第二信使和神经递质，也是一个活性自由基，可调节细胞与细胞间的信息，参与细胞免疫反应，介导细胞毒性，各种免疫细胞的激活均以NO为效应分子。本研究发现急性胆道感染时NO含量显著升高，而施以中药治疗的大鼠全身炎症反应减轻，NO含量也同步下降，提示“清热通下”调控胆道感染时炎症反应的机制可能与NO有关。
    ［参考文献］
    1  高  炬, 张静, 朱培庭. 锦红片治疗急性胆道感染的临床研究［J］. 上海中医药大学学报, 2002, 16(3): 4243.
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    3  王伟军.肠道细菌移位与外科临床的联系［J］. 国外医学创伤与外科基本问题分册, 1994, 15(3): 135139.
    4  曹建西, 侯智亮, 彭红光. 生大黄配合抗生素治疗急性重症胆管炎24例［J］. 中医杂志, 2004, 45(2): 127128.
    5  胡家石, 吴咸中. 内镜鼻胆管引流清解灵治疗急性重型胆管炎的临床观察［J］. 中西医结合杂志, 1989, 9(3): 144147.
    6  天津市南开医院, 遵义医学院主编.新急腹症学［M］. 北京: 人民卫生出版社, 1978. 416423.
    7  Fong Y, Moldawer LL, Shires GT, et al. The biologic characteristics of cytokines and their implication in surgical injury［J］. Surg Gynecol Obstet, 1990, 170(4): 363378.
    8  梁华平. 创伤后白介素2产生受抑的机制及其研究进展［J］. 国外医学军事医学分册, 1991, 8(4): 145149
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