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小鼠心肌组织裂解上清液诱导小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞凋亡           ★★★ 【字体：小 大】
小鼠心肌组织裂解上清液诱导小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞凋亡
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-1    
作者：王玮，张文艳，吴建军，类延花，金晶，方草晖，胡勇，王明丽
【关键词】  心肌上清液
    Apoptosis of mouse myeloma Sp2/0 cells induced by supernatant of mouse cardiac muscle lysate
　　【Abstract】 AIM: To study the roles of mouse cardiac muscle lysate supernatant in inducing the apoptosis of mouse myeloma Sp2/0 cells. METHODS:  Various concentrations (1∶6, 1∶12, 1∶24) of mouse cardiac muscle lysate supernatant and cyclophosphamide were added into the Sp2/0 cell culture wells. After 24 h, microscope was used to observe the morphological changes of Sp2/0 cells and apoptosis rate was determined by flow cytometry after 48 h. Morphological changes of Sp2/0 cells cocultured with mouse cardiac muscle cells were observed after 10 h. The apoptosis of Sp2/0, Hela, Hep2 and Vero cells was induced with various concentrations (1∶5, 1∶10, 1∶20 and 1∶40) of mouse cardiac muscle lysate supernatant, liver lysate supernatant, thymus lysate supernatant and cyclophosphamide, and then the difference of apoptotic rate among them was compared.  RESULTS:  Mouse cardiac muscle lysate supernatant could induce the apoptosis of the Sp2/0 cells and the apoptotic rate increased in a concentrationdependent manner, but there was no difference between mouse cardiac muscle lysate supernatant group and cyclophosphamide group. After a 10hour coculture with mouse cardiac muscle cell lysate, the apoptosis of  a few Sp2/0 cells was seen. The mouse cardiac muscle lysate supernatant, liver lysate supernatant and thymus lysate supernatant could all induce apoptosis of the Sp2/0, HeLa, Hep2 and Vero cells. But the effect of the mouse cardiac muscle lysate supernatant was more obvious and permanent. CONCLUSION:  The mouse cardiac muscle lysate supernatant can significantly induce apoptosis of mouse myeloma Sp2/0 cells.
　　【Keywords】 cardiac muscle lysate supernatant; apoptosis; mouse myeloma Sp2/0 cell
　　【摘要】 目的: 研究小鼠心肌上清液诱导小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞凋亡的作用. 方法：  在Sp2/0细胞培养孔中，分别加入不同稀释度(1∶6, 1∶12, 1∶24)的小鼠心肌上清液和环磷酰胺， 24 h后镜下观察细胞形态，并于48 h后流式细胞仪检测凋亡细胞的比率；同时，Sp2/0细胞和小鼠心肌细胞共培养，10 h后观察Sp2/0细胞形态学变化；并用不同稀释度（1∶5, 1∶10, 1∶20, 1∶40）小鼠心肌裂解上清液、肝脏裂解上清液、胸腺裂解上清液及环磷酰胺诱导Sp2/0, HeLa, Hep2和Vero细胞凋亡，并比较其差异.  结果: 不同稀释度的心肌裂解上清液均可诱导Sp2/0细胞的凋亡，尤以高稀释度更明显；小鼠心肌细胞与Sp2/0细胞共培养10 h后,少部分Sp2/0细胞出现凋亡；小鼠心肌裂解上清液、肝脏裂解上清液、胸腺裂解上清液均可引起Sp2/0, HeLa, Hep2和Vero细胞发生凋亡，但小鼠心肌裂解上清液作用明显，且作用时间持久. 结论: 小鼠心肌组织裂解上清液具有明显诱导小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞凋亡的作用.
 
　　【关键词】 心肌上清液；细胞凋亡；小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞
　　0引言
　　细胞凋亡与肿瘤的发生发展密切相关，已成为研究热点［1］，许多预防治疗肿瘤的药物、细胞因子等抑制肿瘤细胞生长的机制之一是诱导肿瘤细胞凋亡. 我们从细胞凋亡的角度探讨心肌上清液诱导小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞凋亡.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　Balb/c 20只8周龄小鼠，雌雄各半，体质量约250 g，由安徽安科生物工程股份有限公司动物室提供；环磷酰胺(2 g/L)由湖北科利药业股份有限公司生产; DMEM液由美国生命技术公司生产；胎牛血清由杭州四季青公司提供；流式细胞仪（日本产）；Leica荧光显微镜(德国Leica公司)；CO2温箱(美国产)；紫外分光光度计（上海产）. Sp2/0,  HeLa,  Hep2和Vero细胞株均来源于中国预防科学院病毒所，均以100 mL/L胎牛血清＋DMEM液为培养液，按本室常规方法在CO2温箱中培养；乳鼠心肌细胞培养：  取Balb/c新生红皮乳鼠20只，在无菌操作下取出心脏，用PBS冲洗3遍，以眼科剪剪成1 mm3碎块，洗涤，后加2.5 g/L胰蛋白酶液37℃消化20 min，吹打3次，吸取上层细胞悬液，以同样的方法消化3次，直到组织块完全消化为止，以1500 r/min离心8 min，细胞沉淀用200 mL/L胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，接种到培养瓶内，放置于50 mL/L CO2温箱，待用；组织上清液的制备：  取Balb/c小鼠20只，麻醉后在无菌操作下取出心脏、肝脏和胸腺组织，用PBS 30 mL反复冲洗，碾磨，收集组织细胞悬液在Ep管中，放置-80℃冰箱，约1 h后取出，在室温下溶解；再放入-80℃冰箱中，如此反复冻融3次，使组织细胞充分裂解，在离心机中以5000 r/min离心30 min，吸取上清液，用紫外分光光度计分别测其蛋白浓度后，再将浓度统一调至2.23 g/L，然后保存在-20℃冰箱，待用.
　　1.2方法
　　6孔板培养心肌上清液、环磷酰胺诱导Sp2/0细胞凋亡. 在Sp2/0细胞6孔培养板上，取2孔分别滴加心肌上清液1 mL，取3孔分别滴加环磷酰胺200 μL （0.4 mg）, 100 μL（0.2 mg ），24 h后观察结果. 24孔板培养心肌上清液、环磷酰胺诱导Sp2/0细胞凋亡. 取21孔培养Sp2/0细胞，分别滴加不同浓度的心肌上清液和环磷酰胺，另取3孔作为空白对照，48 h后流式细胞仪检测凋亡细胞的比例（每浓度取3孔）. 　心肌细胞培养15 d吸取Sp2/0细胞培养液1 mL，加入心肌细胞培养瓶内，观察心肌细胞培养瓶内的Sp2/0细胞形态学变化. 不同浓度小鼠心肌上清液、肝脏上清液、胸腺上清液同环磷酰胺诱导小鼠骨髓瘤细胞凋亡试验: 将制备的心脏、肝脏和胸腺组织裂解上清液用PBS分别稀释为1∶5, 1∶10, 1∶20, 1∶40，分别取1 mL接种Sp2/0， HeLa， Hep2和Vero细胞，分别于12, 24和48 h观察细胞形态变化.
 
　　统计学处理： 实验数据采用SPSS10.0统计软件进行ANOVA分析.
2结果
 
　　6孔板培养心肌上清液、环磷酰胺诱导24 h后Sp2/0细胞密度明显减小，细胞间隙增大，48 h后部分Sp2/0细胞由圆形变为多边形，细胞体积缩小，出现一些密度增大的颗粒，个别细胞膜破裂，释放出一些细胞碎片；72 h后约30%～40%细胞破裂，凋亡细胞的比例分别为：加心肌上清液为38.7%，加环磷酰胺为19.8%，空白对照为15.8%.  24孔板培养心肌上清液、环磷酰胺诱导Sp2/0细胞凋亡试验中，空白对照与2， 3， 5， 6组有显著性差异（P<0.05）,2组与5组, 3组与6组,1, 4组与7组无显著性差异（P>0.05,  Tab 1）.表1心肌上清液和环磷酰胺诱导Sp2/0细胞凋亡比例（略）
　　心肌细胞培养7 d后，可见心肌细胞伸出伪足，14 d后形态比较清晰，相互联结成网. 吸取Sp2/0细胞培养液1 mL,加入心肌细胞培养瓶内，10 h后镜下观察加入心肌细胞培养瓶内的Sp2/0细胞少部分出现凋亡，个别细胞已破裂，释放出一些细胞碎片. 小鼠心肌裂解上清液、肝脏裂解上清液、胸腺裂解上清液均可引起Sp2/0, HeLa, Hep2和Vero细胞发生凋亡，但小鼠心肌裂解上清液比肝脏、胸腺裂解上清液对Sp2/0, HeLa和Hep2细胞作用明显，且作用时间持久（Tab 2）.表2不同组织上清液对细胞生长的抑制作用（略）
　　3讨论
　　细胞凋亡与肿瘤的发生发展关系密切,已成为肿瘤病因学、病理学研究热点［2］，促使人们寻找新的治疗途径［3，4］. 抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的具体机制尚不清楚, 对于刺激与效应之间的联系研究较少,因此对细胞凋亡的研究,将对认识肿瘤发生机制及肿瘤的预防和治疗产生深远的影响［5］. 我们要通过小鼠心肌上清液同环磷酰胺抑制肿瘤细胞生长的效果相比较. 在6孔板试验中，通过不同浓度的心肌上清液、环磷酰胺与Sp2/0细胞共同培养，发现小鼠心肌上清液可明显诱导小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞的凋亡，并随着浓度的增加，凋亡细胞的比例逐渐增多，最终导致Sp2/0细胞的破裂. 而24孔板试验结果发现，与同浓度的环磷酰胺相比较，其诱导细胞凋亡的作用， 经ANOVA分析无显著性差异（P＞0.05）. 另外，在心肌细胞与Sp2/0细胞共同培养的过程中，Sp2/0细胞也发生凋亡，本次试验中诱导细胞凋亡的物质来源尚须进一步研究. 通过心肌、肝脏、胸腺3种上清液对细胞毒性筛选试验表明,心肌上清液还可诱导HeLa和Hep2细胞的凋亡，且比肝脏、胸腺上清液作用明显，作用时间持久，与环磷酰胺无显著性差异(P＞0.05). 这种结果提示心肌上清液中可能有一种或几种物质具有广谱的抑制肿瘤细胞生长的功能.
　　【参考文献】
　　［1］ 邵世和,李咏梅,陈曦，等. 兔血清诱导Shope肿瘤细胞凋亡的实验研究［J］. 吉林医学院学报, 1998;18(1):9-10.
　　Shao SH, Li YM, Chen X, et al. An experimental study on apoptosis induced by rat serum in Shope cancer cells ［J］ . J Jilin Med Coll, 1998;18(1):9-10.
　　［2］ 张晓军,姚天明,王文亮，等. 细胞凋亡的最新研究进展［J］. 第四军医大学学报，2002;23(suppl):42-44.
　　Zhang XJ, Yao TM, Wang WL, et al. The latest research progress of cell apoptosis ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2002;23(Suppl):42-44.
　　［3］ 黄镜，孙燕.  肿瘤药物治疗的新靶点：凋亡［J］. 中国新药杂志，1997;6(6):412.
Huang J, Sun Y. The drug new targets in cancer: Apoptosis［J］. Chin J New Drugs, 1997;6(6):412.
　　［4］ 陈丽荣，郑树. 细胞凋亡在抗肿瘤治疗策略中的地位［J］. 实用肿瘤杂志，1998；12(4):188-190.
　　Chen LR, Zheng S. The role of apoptosis in the strategy of anticancer therapy［J］. J Pract Oncol, 1998;12(4):188-190.
　　［5］ 马祖胜,冯英明,姬统理，等. 表阿霉素和阿霉素诱导人肝癌细胞凋亡［J］. 第四军医大学学报，2001;22(19)1759-1762.
　　Ma ZS, Feng YM, Ji TL, et al. Induction of apoptosis in human liver cancer cells by epirubicin and doxorubicin ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2001;22(19)：1759-1762
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