【关键词】  胃肿瘤

    Role of Helicobacter pylori in development of gastric cancer

　　【Abstract】 AIM: To study the possible carcinogenesis  of Helicobacter pylori(Hp) infection in the development of gastric cancer. METHODS:  Hp was determined by WarthinStarry silver staining in 39 samples of gastric cancer tissue, 24 samples of gastric mucosal atypical hyperplasia tissue and 33 samples of chronic gastritis tissue. HpcagA was determined by polymerase chain reaction (PCR) and the expressions of iNOS, VEGF, p185 and p21 were examined by SP immunohistochemical staining. RESULTS:  The expressions of Hp, HpcagA, iNOS, VEGF, p185 and p21 in gastric mucosal atypical hyperplasia and gastric cancer tissue were significantly higher than those in chronic gastritis. The expressions of iNOS, VEGF and p21 in Hp positive chronic gastritis, gastric mucosal atypical hyperplasia and gastric cancer cases were significantly higher than those in Hp negative cases. The expression of p185 in Hp positive gastric mucosal atypical hyperplasia and gastric cancer cases was significantly higher than that in Hp negative cases. The expression of Hp was positively related with iNOS, VEGF and p21 in chronic gastritis, gastric mucosal atypical hyperplasia and gastric cancer cases. The expression of Hp was positively related with p185 in gastric mucosal atypical hyperplasia and gastric cancer cases. CONCLUSION:  Hp infection leads to the overexpression of HpcagA, iNOS and VEGF, which can stimulate the higher expressions of oncogene cerbB2 and ras. It may be one of the crucial mechanisms of induction of gastric cancer by Hp.

　　【Keywords】 stomach neoplasms; vascular endothelial growth factors;  nitric oxide synthase; oncogene; helicobacter pylori; cytotoxin associated gene

　　【摘要】 目的： 探讨Hp可能的致癌机制. 方法： 采用WarthinStarry嗜银染色法检测胃癌组织39例，胃黏膜不典型增生24例和慢性胃炎组织33例中的Hp感染情况；采用PCR法检测上述标本中HpcagA；采用免疫组化SP法检测组织中iNOS, VEGF, cerbB2和ras癌基因产物p185和p21的表达. 结果： Hp, HpcagA, iNOS, VEGF, p185和p21在不典型增生和胃癌组织中的表达显著高于慢性胃炎组织；Hp阳性慢性胃炎、不典型增生和胃癌组织中iNOS, VEGF和p21的表达显著高于Hp阴性组，Hp阳性不典型增生及胃癌组织中p185的表达显著高于Hp阴性组；慢性胃炎、不典型增生和胃癌组织中Hp与iNOS，VEGF和p21表达呈正相关，不典型增生和胃癌组织中Hp与p185表达呈正相关. 结论： Hp的致癌作用与其HpcagA的过度表达，增强胃黏膜细胞中iNOS和VEGF的表达，促进胃黏膜细胞癌基因cerbB2和ras的活化密切相关.
 
　　【关键词】 胃肿瘤；血管内皮生长因子类；一氧化氮合酶；癌基因；螺杆菌，幽门；细胞毒素相关基因

　　0引言

　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）感染与胃癌的发生发展密切相关［1，2］，但Hp确切的致癌机制尚不清楚. 我们通过对慢性胃炎、胃黏膜不典型增生及胃癌组织中Hp和细胞毒素相关基因（cytotoxin associated gene A, cagA）阳性株感染率，诱导型一氧化氮合酶（inducible NOS, iNOS），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF），cerbB2和ras癌基因产物p185和p21蛋白表达情况及Hp与iNOS, VEGF, p185和p21蛋白表达的相关性研究，探讨Hp可能的致癌机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　解放军第5医院200201/200312纤维内窥镜活检存档蜡块标本96例，胃癌39例，男32例，女7例，平均年龄63.4（34~87）岁；胃黏膜不典型增生24例，男17例，女7例，平均年龄59.9（47~79）岁；慢性胃炎33例，男14例，女19例，平均年龄46.8（19~92）岁.

　　1.2方法

　　标本40 g/L甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，4 μm厚连续切片. Hp感染采用WarthinStarry嗜银染色（WS染色），Hp呈棕黑色，弯曲成弧形、S形或海鸥状，多位于胃粘膜表面和/或胃小凹及胃癌旁黏膜腺窝内（Fig 1）. HpcagA基因的检测采用PCR法. cagA引物序列： 引物1： 5′GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG3′，引物2： 5′CTGCAAAAGATTGTTTGCGAGA3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；TagDNA酶、PCR染液购自北京赛百圣基因技术有限公司；dNTP购自南京生兴生物技术有限公司. 取石蜡块切片3片（厚12 μm），经二甲苯脱蜡后，消化液（500 mg/L蛋白酶K, 10 mmol TrisHCI pH 8.0, 10 mmol NaCl, 1 mmol EDTA, 100 g/L SDS）消化，酚氯仿抽提DNA，-20℃备用. PCR反应体系为50 μL，包括DNA模板2 μL, cagA引物1（upward） μL, cagA引物2（downward） 0.75 μL, TagDNA酶0.5 μL, 10×Tag缓冲液5 μL, PCR染液5 μL, dNTP 1 μL, ddH2O 35 μL. PCR反应条件： 95℃预变性4 min后，95℃变性60 s, 50℃退火60 s, 72℃延伸60 s，共30个循环，循环结束后72℃延伸7 min. 反应结束后取13 μL扩增水相用15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，在349 bp出现电泳带为阳性，否则为阴性.

　　iNOS, VEGF, p185和p21的表达 采用免疫组化SP法. 实验试剂iNOS兔抗人多克隆抗体、人抗兔免疫组化试剂盒、iNOS阳性对照片购自武汉博士德公司；VEGF, p185和p21鼠抗人mAb，免疫组化试剂盒及DAB显色液，iNOS，VEGF，p185和p21阳性对照片购自福州迈新生物技术有限公司. 阴性对照以PBS代替第一抗体，操作方法均按试剂盒说明书进行. iNOS和VEGF主要为细胞质着色（Fig 2），p185和p21癌基因蛋白主要表达在细胞质和/或细胞膜（Fig 3），以上部位出现棕黄色颗粒视为阳性细胞，计数5个高倍视野，以阳性细胞数所占比例分为“-”： 阳性细胞数<5%；“+”： 5%≤阳性细胞数<25%；“”： 25%≤阳性细胞数<50%.