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| 突变型与野生型TNF | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-1  |
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Apoptosis of tumor cells induced by mutant and wild type TNFα 【Abstract】 AIM: To compare the apoptosisinduced ability of recombinant human mutant type 471 rhTNFα (mt 471rhTNFα) with that of wild type rhTNFα (wt rhTNFα) and to study the apoptotic mechanism induced by mt 471rhTNFα. METHODS: The apoptosis of ZR751 cells, a breast cancer cell line, induced by mt 471rhTNFα or wt rhTNFα was analyzed and compared by 20 g/L agarose gel electrophoresis and flow cytometry techniques. The activation profiles of nuclear factor NFκB in ZR751 cells untreated and treated by mt 471rhTNFα or wt rhTNFα were detected using Trans AMTM NFκB p65 kit based on ELISA for further study of the apoptotic mechanism induced by mt 471rhTNFα. RESULTS: The results from 20 g/L agarose gel electrophoresis of genomic DNA indicated that ZR751 cells treated by mt 471rhTNFα provided a typical apoptotic ladder pattern of DNA fragmentation, whereas weakened ladders were observed in ZR751 cells treated by wt rhTNFα. Flow cytometry showed that the cell apoptotic rate in mt 471rhTNFα treated group was 43%, but 25% in wt rhTNFα treated group. The mt 471rhTNFα held a strong apoptosisinducible ability. The results of DNAbinding activity of NFκB showed that NFκB activation induced by wt rhTNFα was significantly higher than that of mt 471rhTNFα when the protein concentration of mt 471rhTNFα or wt rhTNFα reached 50 μg/L (P=0.002). CONCLUSION: The apoptosisinduced ability of mt 471rhTNFα is superior to that of wt rhTNFα. One of the possible reasons for the enhanced apoptosisinduced ability may be that NFκB activation is inhibited in tumor cells treated with mt 471rhTNFα. 【Keywords】 neoplasms; mutant type 471rhTNFα; wild type rhTNFα; NFkappaB; apoptosis 【摘要】 目的： 比较重组人突变型471rhTNFα（mt 471rhTNFα）与野生型rhTNFα（wt rhTNFα）诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力，并对mt 471rhTNFα诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用机制进行初步研究. 方法： 以乳腺癌细胞系ZR751细胞为靶细胞，应用基因组DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞技术分析mt 471rhTNFα与wt rhTNFα诱导肿瘤细胞凋亡的情况；利用以ELISA为基础的Trans AMTM NFκB p65试剂盒检测经mt 471rhTNFα或wt rhTNFα处理的ZR751细胞核因子NFκB的活化情况，以便对其诱导凋亡的机制进行初步的研究. 结果： 20 g/L琼脂糖凝胶电泳显示，mt 471rhTNFα处理组的ZR751细胞基因组DNA呈现明显的ladder状分布，wt rhTNFα处理组的“ladder”条带明显减弱；流式细胞仪分析显示，mt 471rhTNFα诱导的细胞凋亡峰面积高于wt rhTNFα处理组. NFκB活化检测结果显示，当两型rhTNFα浓度增高到50 μg/L时，wt rhTNFα处理组的NFκB的活化量明显高于同浓度的mt 471rhTNFα处理组（P=0.002）. 结论： mt 471rhTNFα诱导肿瘤细胞凋亡的能力明显优于wt rhTNFα；肿瘤细胞内NFκB活化明显受抑是mt 471rhTNFα诱导凋亡能力增强的主要原因之一. 【关键词】 肿瘤；突变型471rhTNFα；野生型rhTNFα； NFκB；细胞凋亡 0引言 人肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha, TNFα），主要由巨噬细胞产生，是具有多种生物学活性的细胞因子. mt 471rhTNFα是删除wt TNFαN端的7个氨基酸，并将Pro8Ser9Asp10置换为Arg8Lys9Arg10［1］的突变体. 这种突变并不改变TNFα分子的高级结构，仍然形成具有生物活性状态的三聚体，抗肿瘤作用增强且毒副作用降低，极具开发价值. 我们在获得mt 471rhTNFα重组蛋白的基础上［2-4］，进行新的研究，为mt 471rhTNFα的临床前研究提供实验依据. 1材料和方法 1.1材料 两种基因工程蛋白在大肠杆菌DH5α中进行表达，初步检测具有良好的生物学活性. 乳腺癌细胞系（ZR751）为本室保存. 细胞培养基RPMI1640系GIBCO BRL产品，FCS购自杭州四季青生物技术公司. Trans AMTM NFκB p65 Kit由晶美生物工程有限公司提供. 胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒由碧云天生物技术研究所提供. 1.2方法 1.2.1确定mt 471rhTNFα与wt rhTNFα浓度蛋白溶副作用［5,6］. 为了进一步分析本实验中肿瘤细胞的凋亡是否与NFκB的活化有关，我们采用TRANSAM NFκB转录因子测定试剂盒，此法较凝胶分析更为灵敏，它是以ELISA为基础，将NFκB的p65亚单位结合位点的共有序列，即5′GGGACTTTCC3′包被于96孔板上，细胞核蛋白中转录因子NFκB的活化形式能够与此寡核苷酸特异性结合，而识别转录因子的一抗则与转录因子结合，再用抗IgG偶联物和显色反应，容易得到定量的结果. 实验中，wt rhTNFα处理组的NFκB的活化量显著高于mt 471rhTNFα处理组，此结果证实了mt 471rhTNFα与TNFR2的结合力降低，使NFkB的活化受到抑制这一设想. wt rhTNFα在与TNFR1或TNFR2结合时并没有明显的选择性，它与受体结合后不仅介导凋亡信号的发生，同时也具有部分活化NFkB的作用，因此，wt rhTNFα只可以引起轻微的凋亡；而mt 471rhTNFα与TNFR2的亲和力降低，造成NFκB的活化量明显减少，引起大量的靶细胞发生凋亡，因此mt 471rhTNFα可能具有更强的抗肿瘤作用. 研究认为，NFκB是一种广泛分布的多效性的核因子［7,8］，它可以调节一些编码细胞因子、细胞黏附分子和生长因子的基因表达［9］，为大部分肿瘤细胞提供有重要意义的生存蛋白，如IAP家族、survivin蛋白等；激活凋亡抑制基因的转录，如cmyc，CD40L等，抑制了肿瘤细胞的凋亡而促进其生存. 目前，NFκB已经成为人们密切关注的抗癌药物治疗的靶点. 我们推测mt 471rhTNFα是通过下调NFκB的抑凋亡能力，而拥有了相对较强的抑制细胞生长、诱导肿瘤细胞发生凋亡的能力. 值得注意的是细胞凋亡并不只是线性通路，而更可能存在凋亡信号分子相互影响的环性通路. 尤其是半胱天冬氨酸酶、线粒体膜Bcl2 家族以及细胞色素C 间存在的相互作用，使得上游分子和下游分子的凋亡信号可以呈环形级联放大，也可以由一些抑制凋亡的分子如 Bcl2 等阻断这种环形放大的级联效应，从而有效地抑制凋亡［10］. 因此，究竟mt 471rhTNFα是否存在其它诱导肿瘤凋亡的机制，有待于我们进一步的研究. 【参考文献】 ［1］ Masegi T, Kato A, Kitai K, et al. Characterization of a novel human tumor necrosis factoralpha mutant with increased cytotoxic activity ［J］. Jpn J Cancer Res, 1995; 86(1):72-80. ［2］ 李瑶琛，孔令洪，王一理，等. 重组人突变型471TNFα及野生型TNFα的表达及活性初步鉴定［J］. 西安交通大学学报（医学版）,2003;24(1):14-16. Li YC, Kong LH, Wang YL, et al. The expression of recombinant human mutant 471TNFα and wild type TNFα and the primary identification of their bioactivities ［J］. J Xian Jiaotong Univ (Med Sci), 2003;24(1):14-16. ［3］ 孔令洪，李瑶琛，王一理，等. 人突变型TNFα工程菌发酵培养的实验研究［J］. 西安交通大学学报（医学版）,2003;24(3): 211-214. Kong LH, Li YC, Wang YL, et al. Study on fermentation of recombinant bacterial strain of human mutant tumor necrosis factor α ［J］. J Xian Jiaotong Univ (Med Sci), 2003;24 (3): 211-214. ［4］李瑶琛，孔令洪，王一理，等. 人重组TNFα突变体471蛋白的初步纯化及生物学活性［J］. 细胞与分子免疫学杂志, 2003 ;19 (4): 409-412. Li YC, Kong LH, Wang YL, et al. Study on the preliminary purification and bioactivity of recombinant human TNF-α mutein 471 ［J］. Chin J Cell Mol Immunol, 2003;19(4): 409-412. ［5］ Lejeune F, Lienard D, Eggermont A, et al. Clinical experience with highdose tumor necrosis factor alpha in regional therapy of advanced melanoma ［J］. Circ Shock, 1994;43(4):191-197. ［6］ Banno T, Gazel A, Blumenberg M. Pathwayspecific profiling identifies the NFkappa Bdependent tumor necrosis factor alpharegulated genes in epidermal keratinocytes ［J］. J Biol Chem, 2005; 280(19): 18973-18980. ［7］ Mitsiades N, Mitsiades CS, Poulaki V, et al. Biologic sequelae of nuclear factorkappaB blockade in multiple myeloma: Therapeutic applications ［J］. Blood, 2002;99(11):4079-4086. ［8］ Okahashi N, Inaba H, Nakagawa I, et al. Porphyromonas gingivalis induces receptor activator of NFkappaB ligand expression in osteoblasts through the activator protein 1 pathway ［J］. Infect Immun, 2004;72(3):1706-1714. ［9］ Scaife CL, Kuang J, Wills JC, et al. Nuclear factor kappaB inhibitors induce adhesiondependent colon cancer apoptosis: Implications for metastasis ［J］. Cancer Res, 2002;62(23):6870-6878. ［10］ Hengartner MO. Apoptosis. Death cycle and Swiss army knives ［J］. Nature, 1998;391(6666):441-442 |
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