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| KDR siRNA表达载体的构建和鉴定 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-4  |
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【关键词】 血管内皮生长因子受体2 Construction and identification of siRNA expression vector targeting KDR 【Abstract】 AIM: To construct pSilencerTM3.1H1 small inferfering RNA （siRNA） expression vector targeting human KDR gene and to observe its silencing effect in the PC3 prostate cancer cell line. METHODS: The designed oligos targeting KDR were cloned into the pSilencerTM3.1H1 neo vector, which was lineated after BamHⅠ and HindⅢ digestion. The recombimant vectors were confirmed by enzyme digestion analysis and DNA sequencing.The recombimant vectors of pSilencer 3.1KDR1, pSilencer 3.1KDR2 and pSilencer 3.1KDR3 were transfected by liposomemediated transfection into the PC3 prostate cancer cell line with high metastasis potential. At 72 h after transfection, the expression of KDR at the levels of mRNA and protein was detected by RTPCR and Western blotting. RESULTS: The pSilencerTM3.1H1 siRNA expression vectors were constructed and confirmed after the enzyme digestion analysis and the DNA sequencing. The siRNA expression vectors of pSilencer 3.1KDR1, pSilencer 3.1KDR2 and pSilencer 3.1KDR3,were successfully constructed.pSilencer 3.1KDR3 was most effective in the 3 which downregulated 55% mRNA and protein of KDR at 72 h after transfection. CONCLUSION: pSilencerTM3.1H1 siRNA expression vectors targeting KDR were successfully constructed. The expression of KDR gene was inhibited effectively in PC3 cells transfacted by pSilencer 3.1KDR3,which laid a basis for its application in the treatment of prostate cancer. 【Keywords】 vascular endothelial growth factor receptor2; RNA, small interfering; PC3 cell line 【摘要】 目的： 构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(VEGFR2),又称激酶功能区受体（KDR）的pSilencerTM3.1 siRNA(small interfering RNA)表达载体，并在前列腺癌细胞PC3中观察其干扰效果. 方法： 设计针对KDR基因编码区的寡核苷酸链，体外退火后克隆入经BamHⅠ, HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencerTM3.1H1 neo中，对重组质粒进行酶切分析和DNA系列测定. 以脂质体法将pSilencerTM3.1H1 neo空载体和3个(pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3)重组质粒分别导人PC3前列腺癌细胞系. 72 h后用RTPCR和Western blotting技术检测各实验组前列腺癌细胞内KDR mRNA及蛋白水平的表达情况. 结果： 经酶切鉴定及DNA测序，重组质粒中已插入了目的基因片断. 转染KDRsiRNA的前列腺癌细胞，72 h后，而以pSilencer3.1KDR3的抑制KDR mRNA及蛋白表达效果最为有效，其抑制率约为55%. 结论： 成功构建了针对KDR的RNA干扰表达载体pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3, pSilencer3.1KDR3能有效抑制KDR在前列腺癌细胞中表达，为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础. 【关键词】 血管内皮生长因子受体2；RNA，小分子干扰；PC3细胞系 0引言 血管内皮生长因子受体Ⅱ(vascular endothelial growth factor receptorⅡ, VEGFR2)，又称激酶功能区受体（kinase domain receptor, KDR)，在血管内皮和部分肿瘤细胞上特异性表达，对于VEGF 的信号转导及血管内皮生成起主导作用，在肿瘤发生、发展中起重要的调节作用. 研究表明，人前列腺癌细胞中有VEGF和KDR表达，存在VEGFKDR 自分泌途径，与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关［1-2］. RNA干扰 (RNA interference, RNAi)是指双链RNA介导的、序列特异的转录后基因沉默的过程，它作为新兴的基因阻断技术,目前已广泛应用于基因功能及基因治疗的相关研究. 我们通过构建KDR基因特异性small interfering RNA(siRNA)表达载体，检测其对前列腺癌细胞系PC3中KDR基因的沉默作用，为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础. 1材料和方法 1.1材料pSilencerTM3.1H1 neo质粒购自美国Ambion公司；KDR特异性DNA片断由北京赛百胜公司合成；BamHⅠ, HindⅢ限制性内切酶，T4DNA连接酶，DNA酶Ⅰ， Taq酶购自大连宝生物公司；去内毒素质粒提取和反转录试剂盒购自美国Promega公司；RPMI1640培养基、RNA提取、Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；PC3细胞株，DH5a菌种为本室保存；小鼠抗人KDR单克隆抗体购自R&D公司；免疫印记所用二抗（羊抗鼠）、DAB显色液均购自武汉博士德公司；GAPDH内参及其抗GAPDH单抗均购自上海康成生物有限公司；Mini2D cell型电转印仪为BioRAD公司生产；DU800核酸蛋白分析仪为贝克曼公司产品；FR200图像分析系统为上海复日科技公司产品；pEGFPN2 质粒由第四军医大学微生物学教研室韦三华博士惠赠. 1.2方法 1.2.1siRNA靶序列的设计根据shRNA设计原则［3］及KDR(基因号AF063658)cDNA序列，使用美国Ambion公司在线设计软件设计针对KDR基因编码区（A： 395414；B： 29692988；C： 39063925）特异性插入片断序列共三对六条，分别命名为（pSilencer 3.1KDR1, pSilencer 3.1KDR2, pSilencer 3.1KDR3）. pSilencer 3.1KDR1：正义链为5′GATCCGCATGGAGTCGTGTACATTATTCAAGAGATAATGTACACGACTCCATGTTTTTTGGAAA3′；反义链为5′AGCTTTTCCAAAAAACATGGAGTCGTGTACATTATCTCTTGAATAATGTACACGACTCCATGCG3′；pSilencer 3.1KDR2： 正义链为5′GATCCGCTCCTGAAGATCTGTATATTCAAGAGATATACAGATCTTCAGGAGCTTTTTTGGAAA3′；反义链为5′AGCTTTTCCAAAAAAGCTCCTGAAGATCTGTATATCTCTTGAATATACAGATCTTCAGGAGCG3′；pSilencer 3.1KDR3： 正义链为5′GATCCGCGGCTACCAGTCCGGATATTCAAGAGATATCCGGACTGGTAGCCGCTTTTTTGGAAA3′；反义链为5′AGCTTTTCCAAAAAAGCGGCTACCAGTCCGGATATCTCTTGAATATCCGGACTGGTAGCCGCG3′. 黑体部分为KDR基因特异性序列，序列经同源性分析后，提交公司合成. 1.2.2KDRsiRNA表达载体的构建合成编码发夹结构siRNA的正义链和反义链，分别取5 μL 正反义寡核苷酸(终浓度均为25 mol/ L)，10 μL 5×退火缓冲液(500 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris, pH 7.6)，加入30 μL去离子水于95 ℃水浴中5 min，然后自然冷却至室温. 将退火后的双链siRNA模板与载体于16 ℃连接过夜，以连接产物转化E.coli DH5a感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选重组载体. 扩增白色的抗性菌落并提取质粒，以BamHⅠ, HindⅢ双酶切鉴定重组质粒. 收集酶切鉴定正确的重组质粒，提交大连宝生物公司进行 DNA序列测定. 1.2.3转染用质粒DNA的制备、纯化及定量以去内毒素质粒提取试剂盒，分别提取pSilencerTM3.1H1 neo空载体和KDRsiRNA 重组质粒. 经分光光度计和电泳检测，A260nm/A280 nm>1.8，且无任何降解的DNA用于转染. 1.2.4KDRsiRNA质粒的细胞转染用去内毒素质粒提取试剂盒提取测序正确的各重组质粒和pEGFPN2质粒. 将PC3细胞按1×105/孔的数量转种于6孔培养板，RPMI1640培养液（含100 mL/L小牛血清，100万U/L青霉素，100万U/L链霉素），37℃, 5 mL/L CO2培养至80%左右，更换无抗生素、无血清的RPMI1640培养液继续培养6 h，分别用各重组质粒转染PC3细胞，使用美国Ambion公司提供的含有与任何已知序列不同源的shRNA序列的质粒为阴性对照和未转染照. 每孔质粒用量为2 μg，脂质体用量为5 μL. 以pEGFPN2质粒同步转染检测转染效率. 转染后6 h更换为含200 mL/L小牛血清无抗生素RPMI1640培养液. 瞬时转染后72 h收获细胞检测KDR的表达水平. 1.2.5KDRsiRNA转染细胞KDR mRNA表达的RTPCR检测转染后72 h，提取总RNA并定量，用DNA酶Ⅰ处理总RNA以去除DNA污染，各实验组取同等量的RNA反转录后进行PCR. pSilencer 3.1KDR1位点PCR引物正义链： 5′GCCCAATAATCAGAGTGGCAGTG3′，反义链： 5′GAGACGGACTCAGAACCACATCA3′，产物长度506 bp；pSilencer 3.1KDR2位点PCR引物正义链： 5′GCACGATTCCGTCAAGGG3′，反义链： 5′TTCAAAGGGAGGCGAGCA3′，产物长度383 bp； pSilencer 3.1KDR3位点PCR引物正义链： 5′ACGGACAGTGGTATGGTT3′，反义链： 5′CGAGTCAGGCTGGAGAAT3′，产物长度279 bp. 内参照βactin, PCR引物正义链： 5′GCTCGTCGTCGACAACGGCTC3′，反义链： 5′CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC3′,产物长度353 bp. PCR产物经琼脂糖电泳后于FR200图像分析系统分析. 1.2.6KDRsiRNA转染细胞KDR蛋白表达的Western blotting检测转染后72 h，提取细胞总蛋白并定量，调整蛋白浓度至相同水平进行SDSPAGE电泳，电泳完毕后，marker的条带进行考马斯亮兰染色，余下的胶按操作说明装入电转印仪，100 V电转45 min后加50 g/L脱脂奶粉封闭；加1/1000 PBS稀释的KDR抗体，4℃孵育过夜；PBSTween洗涤，加1/1000稀释的二抗室温60 min；PBSTween洗涤后DAB显色30 min，于FR200图像分析系统分析结果. 2结果 2.1KDRsiRNA片段的获得合成的KDRsiRNA寡核苷酸片段退火后得到约66 bp的DNA片段,提示退火成功. 2.2pSilencerTM3.1/KDRsiRNA 重组质粒的构建及鉴定酶切后的琼脂糖电泳图可见一大小为66 bp左右的酶切片断，与设计合成的KDR基因特异性序列大小相符（图1）. 将各重组质粒分别命名为pSilencer 3.1KDR1, pSilencer 3.1KDR2, pSilencer 3.1KDR3，阴性对照质粒命名为pSilencer 3.1NC (negative control). DNA序列测定结果表明，各序列已成功插入了pSilencerTM3.1H1 neo载体（图2）. M: DNA marker； 1： pSilencer3.1KDR1； 2： pSilencer3.1KDR2； 3： pSilencer3.1KDR3； 4： pSilencer3.1H1neo. 图1重组pSilencerTM3.1/KDRsiRNA表达载体的双酶切鉴定（略） 2.3转染效率的观察转染后24 h，经荧光倒置显微镜下观察pEGFPN2质粒同步转染的PC3，结果显示，此次转染的效率约为60%~70%. 2.4KDRsiRNA转染细胞的RTPCR鉴定将构建好的KDR的RNAi载体pSilencer 3.1KDR1, pSilencer 3.1KDR2和pSilencer 3.1KDR3以及pSilencer3.1NC以脂质体分别转入PC3前列腺癌细胞，提取各组细胞总RNA 经RTPCR扩增KDR片段，琼脂糖凝胶电泳结果(图3)显示，pSilencer 3.1KDR1和pSilencer 3.1KDR2重组质粒转染的PC3细胞KDR的mRNA水平变化不明显，pSilencer3.1KDR3重组质粒转染的PC3细胞的KDR mRNA水平较亲本细胞和阴性质粒转染细胞明显下调，抑制率约为55%. A: pSilencer3.1KDR1； B： pSilencer3.1KDR2； C： pSilencer3.1KDR3. 图2重组pSilencerTM3.1/KDRsiRNA表达载体插入片断的测序结果 （略） M: DNA marker； A1： pSilencer3.1KDR1； A2： pSilencer3.1NC； A3： PC3；A4~A6： βactin; B1： pSilencer3.1KDR2； B2： pSilencer3.1NC； B3： PC3； B4~B6： βactin; C1： pSilencer3.1KDR3； C2： pSilencer3.1NC； C3： PC3； C4~C6： βactin. 图3KDR 表达的RTPCR鉴定2.5KDRsiRNA转染细胞的Western blotting鉴定提取PC3, pSilencer3.1NC, pSilencer3.1KDR1, pSilencer3.1KDR2和pSilencer3.1KDR3（略） 各组细胞总蛋白，行Western blotting检测，鉴定结果见图4. 由图4可见，亲本细胞、阴性质粒转染细胞pSilencer 3.1KDR1和pSilencer 3.1KDR2重组质粒转染的PC3细胞KDR的蛋白总量水平无明显差别，pSilencer3.1KDR3重组质粒转染的PC3细胞，KDR蛋白总量明显下调，抑制率约为55%. 1: pSilencer 3.1KDR1; 2: pSilencer 3.1KDR2; 3: pSilencer 3.1KDR3; 4: pSilencer3.1NC; 5: PC3. 图4KDR表达的Western blotting鉴定（略） 3讨论 血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor, VEGF) 及其受体在肿瘤血管形成中起着关键的调节作用［4-5 ］，能刺激血管内皮细胞分裂、增殖,诱导血管生成,有助于肿瘤的生长和转移. VEGFR家族的成员包括：VEGFR1（Flt1）, VEGFR2（KDR/Flk1）, VEGFR3（Flt4）. KDR 是发挥功能的主要受体，它不仅表达于肿瘤组织的血管内皮细胞，而且表达于肿瘤细胞的胞膜和/或胞质，提示肿瘤细胞分泌的VEGF不仅以旁分泌方式作用于血管内皮细胞并诱导血管新生，也可通过自分泌途径与自身表面的受体结合而促进细胞生长或迁移，从而抑制细胞凋亡. 研究表明阻断VEGF 与KDR 的相互作用能抑制动物体内实体瘤的生长,达到治疗肿瘤、抑制肿瘤生长的目的. Witte 等［6］制备的可与KDR特异性结合的单抗DC101 ,在体外能抑制VEGF与受体的结合,阻断VEGF诱导的信号传导. Bruns 等［7］用DC101 治疗前列腺转移直肠癌小鼠模型,发现该治疗不仅抑制小鼠肿瘤血管的生成,而且导致肿瘤内皮细胞的死亡. 这些结果表明抑制肿瘤细胞和/或肿瘤血管内皮细胞上VEGF受体的表达，不仅可阻止肿瘤细胞的生长，也可抑制肿瘤血管的生成，从而阻断肿瘤的生长和转移. RNAi技术是指一短双链RNA (21 bp)可使具有同源结构的RNA降解,它是近年来新发现的一个强大的基因研究工具. 将具有反向重复序列的DNA 模板克隆至RNA 聚合酶Ⅲ( Pol Ⅲ) 转录单位中,以质粒DNA 为载体转染哺乳动物细胞,利用细胞中RNA 聚合酶持续转录合成RNA ,这种RNA 内部互补折叠形成短发卡样dsRNA,被RNA酶样物质(Dicer)切割形成21或23个碱基的双链RNA,即siRNA. 由于类似于天然的siRNA，同反义核酸技术和单链RNA相比，siRNA更有效，可在更长的时间内抑制靶基因的表达［8］. 人前列腺癌组织中有VEGF和KDR表达，且VEGF和KDR表达与前列腺癌细胞的生长和转移密切相关. 我们成功构建了3个针对KDR基因的重组转录载体pSilencer 3.1KDR1, pSilencer 3.1KDR2和pSilencer 3.1KDR3. 转染KDRsiRNA的PC3前列腺癌细胞,72 h后KDR mRNA 及蛋白表达下调，而以pSilencer 3.1KDR3的抑制效果最为明显，抑制率约为55%. 构建的RNA干扰表达载体能明显干扰KDR mRNA及蛋白的表达，为进一步研究KDR的功能以及应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础. 【参考文献】 ［1］ Strohmeyer D, Rossing C, Bauerfeind A, et al.Vascular endothelial growth factor and its correlation with angiogenesis and p53 expression in prostate cancer ［J］. Prostate, 2000,45:216-224. ［2］ Ferrer FA, Miller LJ, Andrawis RI, et al. Angiogenesis and prostate cancer: In vivo andivitro expression of angiogenesis factors by prostate cancer cells ［J］. Urology, 1998,51:161-167. ［3］ UiTei K, Naito Y, Takahashi F, et al. Guidelines for the selection of highly effectivesiRNA sequences for mammalian and chick RNA interference ［J］. Nucleic Acids Res, 2004,32(3):936-948. ［4］ Suhardja A , Hoffman H.Role of growth factors and their receptors in proliferation ofmicrovascular endothelial cells ［J］. Microsc Res Tech, 2003,60:70-75. ［5］ Underiner TL, Ruggeri B, Gingrich DE, et al. Development of vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) kinase inhibitors as anti2 angiogenic agents in cancer therapy ［J］. Curr Med Chem, 2004,11:731-745. ［6］ Witte L, Hicklin DJ, Zhu Z, et al. Monoclonal antibodies targeting the VEGF receptor2 ( Flk1/ KDR) as an antiangiogenic therapeutic strategy ［J］.Cancer Metastasis Rev, 1998,17(2):155-159. ［7］ Bruns CJ,Liu W, Davis DW, et al. Vascular endothelial growth factor is an in vivo survival factor for tumor endothelium in a murine model of colorectal carcinoma liver metastases ［J］. Cancer, 2000,89(3):488-499. ［8］ Sui G, Soohoo C, Affar el B, et al. A DNA vectorbased RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99(8):5515-5520 |
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