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不同浓度葡萄糖对MG63细胞株TRAIL表达的影响           ★★★ 【字体：小 大】
不同浓度葡萄糖对MG63细胞株TRAIL表达的影响
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-4    
作者：周玮，姬秋和，张南雁，黄威权
【关键词】  葡萄糖
　　Effects of different concentrations of glucose on expression of TRAIL in MG63 cells
　　【Abstract】  AIM:  To observe the regulative effects of different concentrations of glucose on the expressions of tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand(TRAIL),osteoprotegerin(OPG),and the ligand of osteoprotegerin(OPGL) in osteosarcoma MG63 cells,and to study the role of nonphysiological concentration of glucose in pathogenesis of diabetic osteoporosis.  METHODS: MG63 cells were incubated with glucose at the concentration of  5.5, 16.7, 33.3 mmol/L for 24 h respectively.The expressions of TRAIL, OPG and OPGL mRNA were examined by reverse transcriptase(RT)PCR.Expression and distribution of TRAIL in MG63 cells were investigated by immunohistochemical method.  RESULTS: The mRNA expressions of TRAIL and OPGL in MG63 cells increased in the order of control group, 5.5, 16.7, 33.3 mmol/L glucose groups（P<0.05）,and the expression of OPG mRNA decreased in the same order（P<0.05）.TRAIL mRNA level in 33.3 mmol/L group was significantly higher than that in control group［(1.004±0.070) vs (0.740±0.023), P<0.05］, and the intensity of immunostaining for TRAIL was stronger than that in control group. CONCLUSION: High concentration of glucose could lead to the increasing expression of some boneresorbing cytokines such as TRAIL and OPGL in osteoblasts but the decreasing expression of OPG, which may be one of the key pathogenetic factors of diabetic osteoporosis.
　　【Keywords】 glucose; MG63 cell; tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand
　　【摘要】 目的：   观察不同浓度葡萄糖环境下人成骨肉瘤MG63细胞株肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及其护骨素（OPG）、护骨素配体（OPGL）的表达，探讨糖尿病骨质疏松症的发病机制.  方法：  用不同浓度葡萄糖(5.5, 16.7, 33.3 mmol/L)分别刺激培养的MG63细胞24 h， RTPCR法检测TRAIL， OPG， OPGL  mRNA的表达，免疫组织化学法检测MG63细胞中TRAIL的表达及分布. 结果：   葡萄糖对MG63细胞中TRAIL， OPGL mRNA的表达，均按照对照组、5.5 mmol/L组、16.7 mmol/L组、33.3 mmol/L组顺序递增（P＜0.05），OPG mRNA的表达按照此顺序递减（P＜0.05）. 33.3 mmol/L组TRAIL mRNA的水平明显高于对照组［(1.004±0.070) vs (0.740±0.023), P＜0.05］, TRAIL免疫反应阳性物质密度也明显高于对照组.  结论：   高糖环境可能导致成骨细胞中TRAIL和OPGL表达增多，OPG的表达减少，这可能是糖尿病骨质疏松症的重要发病机制之一.
 
　　【关键词】 葡萄糖；MG63细胞；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体
　　0引言
　　糖尿病易并发骨质疏松症已被公认, 糖尿病对骨代谢的影响主要表现为骨吸收增加,骨形成减少与缓慢,使骨矿物质含量减少和骨质疏松［1］. 确切的细胞机制尚未阐明. 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand, TRAIL）是新发现的肿瘤坏死因子超家族的成员，可表达于人体的许多组织，对许多肿瘤来源的细胞具有很强的杀伤作用［2-3］，可介导病毒引起的凋亡［4-5］，并在一些自身免疫疾病中起作用［6］. 但在糖尿病骨质疏松发病中是否起作用，目前少见报道. 我们观察不同浓度葡萄糖环境下具有人成骨细胞表型特征的MG63细胞株中TRAIL及其护骨素（osteoprotegerin, OPG）、护骨素配体（osteoprotegerin ligand, OPGL）的表达情况, 进一步探讨糖尿病骨质疏松症的发病机制.
　　1材料和方法
　　1.1材料第106代MG63细胞株由中南大学湘雅二医院代谢内分泌研究所惠赠；MEM培养液(Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；牛血清白蛋白、Trizol试剂盒（Gibco公司）；逆转录反应试剂盒（Promega公司）；PCR扩增试剂盒和DNA梯度Marker（TaKaRa公司）；引物由北京三博远志公司合成. 鼠抗人TRAIL mAb（本校免疫学教研室）；生物素标记的羊抗鼠IgG抗体（宝泰克公司）；ABC复合物（华美生物工程公司）；DAB（Sigma公司）.
 
　　1.2方法
　　1.2.1细胞培养将第106代MG63细胞株以5×108/L密度接种于培养瓶或制成单细胞悬液接种于预先放置4张7 mm×22 mm盖玻片的培养皿中,用含100 mL/L胎牛血清、50 mg/L维生素C的无酚红MEM培养液,于37 ℃, 50 mL/L CO2条件下培养,2 d 换液1次.
 
　　1.2.2干预试验接种于50 mL细胞培养瓶的MG63细胞达60%~70% 汇片，行细胞爬片的MG63细胞贴壁后即分别换含1 g/L牛血清白蛋白的无血清MEM培养液培养3 h,再分别用含不同浓度葡萄糖的MEM培养液干预,分为4组： 培养基对照组；5.5 mmol/L组；16.7 mmol/L组；33.3 mmol/L组. 干预24 h后,抽提细胞总RNA行RTPCR操作及免疫组化检测. 以上各组实验均独立重复5次.
 
　　1.2.3RTPCRTrizol抽提MG63细胞总RNA. 取2  μg总RNA，用逆转录试剂盒合成cDNA，再取1  μL cDNA行PCR扩增OPG， OPGL， TRAIL基因，以βactin基因为内对照. OPG上游引物： 5′AGTGGGAGCAGAAGACATTG3′，下游引物： 5′ATTGGACCTGGTTACCTATC3′，扩增长度为268 bp；OPGL上游引物： 5′GCGTCGCCCTGTTCTTCTAT3′，下游引物： 5′TTGGTGCTTCCTCCTTTCAT3′，扩增长度为598 bp；TRAIL上游引物： 5′GGCATTCATTCCTGAGCAACTT3′，下游引物： 5′GATCTCGTGATCTACCCACCTT3′，扩增长度为908 bp. 反应体系为25 μL，双蒸水18 μL， 10×Buffer 2.5 μL, Taq酶0.5 μL，上游引物各2 μL，下游引物各2 μL，模板1 μL. OPG反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s, 55 ℃退火15 s,  72 ℃延伸30 s，共30个循环，最后延伸10 min. OPGL反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s,55 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s,共30个循环，最后延伸10 min. TRAIL反应条件：94 ℃预变性3  min，94 ℃变性30 s,57 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环，最后延伸10 min. 分别取10  μL  PCR扩增产物于含0.5 mmol/L溴化乙锭的20 g/L琼脂糖凝胶电泳并拍照，并用凝胶成像分析系统行条带光密度定量检测，测值与βactin光密度值比较，比值表示各指标的mRNA表达量.
 
　　1.2.4免疫组化细胞爬片利用ABC技术进行免疫组化染色，按免疫组化ABC试剂盒说明书所示步骤染色. 采用OLYMPUS BH2光学显微镜观察并摄片,以正常羊血清及PBS代替一抗染色,作为阴性和空白对照.
 
　　统计学处理： 用SPSS13.0软件包统计分析. 方差齐性时数据用x±s表示，组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSDt检验，方差不齐时数据用中位数（四分位数间距）［M（QR）］表示，采用秩和检验，组间两两比较用Nemenyi法检验.
2结果
　　2.1葡萄糖对MG63细胞TRAIL和OPG mRNA表达的影响RTPCR半定量结果显示,葡萄糖能上调 MG63细胞中TRAIL mRNA的表达. 16.7 mmol/L的葡萄糖即可出现上调作用，并在33.3 mmol/L时上调作用更明显. 高葡萄糖能下调MG63细胞中OPG mRNA的表达，与对照组和5.5 mmol/L葡萄糖组相比，16.7 mmol/L的葡萄糖即可降低OPG mRNA表达，并在33.3 mmol/L时下调作用更明显（表1，图1）. 另一方面，相同浓度的葡萄糖能上调MG63细胞中OPGL mRNA的表达, 按照对照组、5.5 mmol/L组, 16.7 mmol/L组, 33.3 mmol/L组的顺序，OPGL mRNA的A值的M（QR）分别为0.107 (0.008), 0.114(0.015), 0.206 (0.040), 0.234 (0.037),经检验，33.3 mmol/L组的OPGL mRNA表达明显高于对照组（P<0.05，图1).
　　表1不同浓度葡萄糖对MG63细胞TRAIL，OPG及OPGL mRNA表达的影响（略）
　　aP＜0.05 vs对照； cP＜0.05 vs 5.5 mmol/L； eP＜0.05 vs 16.7 mmol/L.
　　2.2葡萄糖对MG63细胞TRAIL免疫组织化学染色的影响TRAIL免疫反应阳性细胞多数呈梭形，少数呈不规则形. 阳性物质呈棕黄色颗粒,位于胞质内，胞核阴性. 在培养基对照组及5.5  mmol/L组中，TRAIL免疫反应产物呈阴性或弱阳性. 在高浓度葡萄糖组中，TRAIL免疫反应阳性物质密度明显增高（图2）.
　　1： 对照组；2： 5.5 mmol/L组；3：16.7 mmol/L组；4：33.3 mmol/L组.
　　图1不同浓度葡萄糖对MG63细胞TRAIL，OPG及OPGLmRNA表达的影响（略）
　　A： 对照组；B： 5.5 mmol/L组；C： 16.7 mmol/L组；D： 33.3 mmol/L组.
　　图2不同浓度葡萄糖对MG63细胞TRAIL免疫反应产物的影响SABC ×200（略）
　　3讨论
　　糖尿病易并发骨质疏松症已被公认,且动物实验表明在糖尿病大鼠病程早期即表现为成骨细胞数下降、破骨细胞数上升，说明骨形成减少，骨吸收相对大于骨形成［7］. 但其确切的细胞机制尚未阐明.
 
　　TRAIL是新发现的肿瘤坏死因子超家族的凋亡分子，可能与多种受体结合，发挥诱导或抗凋亡作用. TRAIL有5个受体：死亡受体（DR4， DR5）、诱骗受体（DcR1， DcR2）和分泌型受体OPG. TRAIL与DR4,DR5相互作用，诱导许多组织来源的肿瘤细胞株迅速凋亡，但不能诱导正常细胞凋亡. TRAIL的两个诱骗受体DcR1缺乏死亡功能区，DcR2只含有死亡功能区的1/3，因而不能介导凋亡，但是可以抑制DR4,DR5介导的凋亡［8］. OPG是一个分泌型的TNF受体，是骨代谢的一个重要的负调控因子，能抑制破骨细胞生成、活化,减少骨吸收［9-11］， 增加骨密度的作用. 它主要通过中和性结合OPGL发挥骨保护作用,后者是诱导破骨细胞生成的关键性细胞因子,通过作用于破骨细胞上的受体RANK,刺激破骨细胞形成、分化及活化,增强骨吸收. OPG竞争性结合OPGL,阻断OPGL与其靶信号受体RANK的结合,抑制OPGL/RANK对破骨细胞信号转导的活化,减少破骨细胞生成，发挥抗骨质疏松作用. OPG还能通过与TRAIL的竞争性结合，抑制TRAIL和死亡受体结合，来抑制TRAIL诱导细胞凋亡的作用. 反之，TRAIL可结合OPG,并相互中和对方的功能［9］,即可间接解除OPG对OPGL的结合，抑制它的抑制破骨细胞的发生和增加骨密度的作用. 可见OPG和TRAIL是相互抑制的.
 
　　我们从基因水平观察了不同浓度葡萄糖对MG63细胞株中OPG,OPGL表达的影响，发现高糖能使OPGLmRNA表达增加,呈剂量依赖性.  高糖同时能抑制MG63细胞中OPG mRNA的表达,使细胞内OPG/OPGL比率降低. 提示高糖对成骨细胞中OPG/OPGL水平的调节,可能是糖尿病导致骨质疏松症的机制之一. 我们从基因及免疫组化的角度，还观察到了不同浓度葡萄糖对MG63细胞株TRAIL表达的影响，发现随着葡萄糖浓度的升高，TRAIL mRNA表达增多. TRAIL分布于胞质内，高糖环境可导致TRAIL免疫反应阳性物质明显增多. TRAIL是与细胞凋亡有关的细胞因子，这提示了高浓度的葡萄糖可能是通过TRAIL以自分泌或旁分泌的形式介导成骨细胞的凋亡，从而调节成骨细胞的数量，导致骨形成减少、骨质疏松的发生. 另一方面，高糖环境下TRAIL表达的增多，可竞争性结合OPG，阻断后者对OPGL的结合，促进了破骨细胞数目的增多及分化成熟.
　　【参考文献】
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