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短发夹RNA靶向抑制suvivin基因对人胶质瘤U251细胞凋亡和细胞周期的影响           ★★★ 【字体：小 大】
短发夹RNA靶向抑制suvivin基因对人胶质瘤U251细胞凋亡和细胞周期的影响
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-4    
作者：徐如祥，涂艳阳，姜晓丹，封江南
【关键词】  短发卡RNA
　　Role of short hairpin RNA targeting survivin in apoptosis and G2/M cell cycle arrest in glioma cell line U251
 
　　【Abstract】 AIM:  To construct a recombinant short  hairpin RNA (shRNA) expression vector targeting survivin and investigate apoptosis and cell cycle arrest in glioma cell line U251 induced by survivintargeting small interfering RNA (siRNA). METHODS:  Three siRNA sequences of 19 nucleotides were derived from the fulllength coding region of survivin gene and then 2 complementary oligonucleotides with 9 bases for loop sequence were designed for shRNA DNA templates. The shRNA templates were cloned into siRNA expression vector pGenesil1 to generate survivintargeting siRNA expression vector pGenesil1/survivin encoding 3 shRNAs targeting survivin by digestion and ligation step by step. pGenesil/survivin was transfected into U251 by Metafectene. Realtime quantitive PCR and Western blotting were performed to validate the interfering efficacy of survivin at mRNA level and protein level respectively. AnnexinV/PI double staining by flow cytometry  analysis was used to evaluate apoptosis. PI staining was conducted to evaluate cell cycle arrest.  RESULTS: The expression of survivin at both RNA level and protein level were significantly downregulated as validated by realtime quantitive RTPCR and Western bloting. Flow cytometry analysis revealed glioma cell line U251 suffered a notable apoptosis and G2/M arrest after RNA interference mediated by siRNA targeting survivin. CONCLUSION: RNA interference (RNAi) mediated by the siRNA expression vector pGenesil/survivin could significantly downregulate the expression of survivin and induce remarkable apoptosis  and G2/M cell cycle arrest in glioma cell line U251.
 
　　【Keywords】  short  hairpin RNA; survivin;  apoptosis
　　【摘要】　目的： 构建表达靶向抑制survivin基因的表达短发夹结构 (shRNA)的RNA干扰载体，导入人胶质瘤细胞U251中，研究靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导以及细胞周期阻滞作用. 方法： 在survivin全长序列中选取设计3条含19个核苷酸（19nt）靶序列两条反向重复序列，中间以9个核苷酸的茎环序列，两端分别加上对应的酶切位点，分步酶切连接，构建出含有3条shRNA模板且能独立编码shRNA的重组干扰载体pGenesil1/survivin； 采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251；采用荧光定量PCR以及Western bloting分别从mRNA和蛋白水平检测干扰效果；采用AnnexinV/PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡，PI染色检测细胞周期阻滞. 结果：实时荧光定量PCR以及Western blotting检测显示，survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制；流式细胞仪检测分析显示，survivin基因表达被抑制后，U251细胞凋亡率明显增高，细胞周期出现明显的G2/M阻滞. 结论： 靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesil/survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达, 并明显地诱导了U251细胞发生凋亡和G2/M期细胞周期阻滞.
 
　　【关键词】 短发卡RNA；survivin；细胞凋亡
　　0引言
　　RNA干扰技术（RNA interfering, RNAi）是近年来迅速发展起来的生物技术，已成为基因功能研究以及基因治疗的强有力工具［1］. 我们采用小分子干扰RNA（Small interfering RNA, siRNA）介导的RNAi技术，研究靶向抑制survivin对U251细胞的凋亡诱导以及细胞的阻滞作用.
　　1材料和方法
　　1.1材料U251细胞购自上海生物细胞研究所，在含有100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液，37℃，CO2培养箱中培养.  干扰质粒pGenesil1, pEGFP61和pG64购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司. Trizol试剂购自美国MRC公司. BamHⅠ， HindⅢ， EcoRⅠ，SacⅠ， SalⅠ,  PstⅠ内切酶以及反转录试剂盒RevertAidTM first strand cDNA Synthesis Kit购自立陶宛MBI公司. TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DL2000Marker购自大连Takara公司. MetafecteneTM转染试剂购自德国Biontex公司. 胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自上海华舜公司. 质粒大提试剂盒购自德国Qaigen公司. Survivin多抗购自美国Santa Cruz公司. Cy5标记的AnnexinV凋亡检测试剂盒购自美国BD公司. LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ购自罗氏公司.
 
　　1.2方法选取3条符合条件的19nt的siRNA靶序列，中间以9 bp的茎环系列分割反向重复序列，以5个T作为转录中止子，分别在中止信号后3′端加上SacⅠ， EcoRⅠ和SalⅠ的酶切位点，并在外侧的5′端和3′端分别形成BamHⅠ和HindⅢ的粘性末端；同时设计针对EGFP的shRNA转录模板作为阳性对照，由上海英骏生物技术有限公司合成. 三个siRNAsurvivin的转录模板序列分别为： 模板1正义，5′GGACCACCGCATCTCTAC3′；反义，5′TGTAGAGATGCGGTGGTCC3′. 模板2正义，5′GCATTCGTCCGGTTGCGCT3′；反义，5′AGCGCAACCGGACGAATGC3′. 模板3正义，5′GGCTGGCTTCATCCACTGC3′；反义，5′GCAGTGGATGAAGCCAGCC3′. siRNAEGFP转录模板序列为： 正义，5′GTGAACTTCAAGATCCGCC3′；反义，5′GGCGGATCTTGAAGTTCAC3′. 中间的茎环序列为： 正义5′TTCAAGACG3′；反义，5′CGTCTTGAA3′. 用BamHⅠ和HindⅢ双酶切空载体pGenesil1, pEGFP61和pG64. 将合成的对应的发夹结构寡核苷酸单链退火成双链，用T4连接酶定向克隆至上述三个载体，经抗生素筛选，挑选阳性克隆，测序鉴定，同样方法构建靶向针对EGFP的重组干扰载体pGenesil/EGFP；采用分步酶切连接的方法，将3个siRNA模板以及相应U6启动子一起定向克隆至干扰载体pGenesil1，使其含有3个分别带有独立U6启动子的靶向针对survivin基因的siRNA模板，获得能同时表达3个靶向survivin基因的siRNA的重组干扰载体pGenesil1/survivin，测序鉴定. 重组siRNA表达载体转染U251细胞采用MetefecteneTM转染试剂进行转染. 用Trizol从各组U251细胞中抽提总RNA，GeneQuant测定浓度和纯度，Lightcycler实时定量PCR系统检测SYBR Green I嵌入荧光，以评价survivin基因的干扰效果. 转染48 h后，Western blotting检测干扰前后survivin蛋白表达水平变化. Cy5Annexin V/PI双染染法检测凋亡， PI染色流式细胞仪检测细胞周期变化.
2结果
　　2.1干扰效果转染实验组pGenesil1/survivin荧光强度较转染pGenesil空载体组为弱；pGenesil/EGFP 转染组与前两组相比，绿色荧光明显减少，亮度减弱.  survivin基因的mRNA水平被siRNA显著下调.  实时荧光定量RTPCR检测结果显示, U251细胞经特异性 siRNA表达载体pGenesil1/survivin作用后，survivin基因的Ct值由22增加到35，提示survivin基因的mRNA拷贝数明显降低；转染阴性对照组以及阳性对照组survivin基因Ct值无明显变化. survivin蛋白水平被靶向survivin基因的siRNA显著下调，空白对照组、阴性对照组以及转染pGenesil/EGFP阳性对照组survivin蛋白表达未发生明显变化；转染pGenesil/survivin组survivin蛋白表达明显下调(图1).
　　图1Western blotting和实时定量PCR检测靶向survivin基因的干扰效果（略）
　　2.2U251细胞凋亡和细胞周期经转染靶向survivin基因的siRNA表达载体pGenesil1/survivin后，AnnexinV/PI双染阳性细胞明显增加，提示特异性siRNA作用后U251细胞发生了明显的凋亡；转染阴性对照组、阳性对照组以及空白对照组凋亡未发现明显变化. PI染色流式细胞仪分析结果显示，经siRNA作用后，U251细胞处于细胞周期G2/M期的细胞比例明显增加，显示为明显的G2/M期细胞周期阻滞(图2).
图2靶向survivin基因的siRNA作用后不同时间点U251细胞周期分布变化
　　3讨论
        
　　本研究中，我们采用载体介导的RNA干扰技术，构建了靶向survivin基因的shRNA表达载体，导入U251细胞后，成功沉默了survivin基因的表达，诱导U251细胞发生了显著的凋亡和G2/M期细胞周期阻滞，证实以survivin基因为靶点的RNA干扰有效诱导人胶质瘤U251细胞发生凋亡和细胞周期阻滞. 我们首先设计了针对增强绿色荧光蛋白的siRNA，结果显示荧光强度明显减弱，提示pGenesil1系统能有效介导针对靶基因的特异性RNAi；随后，我们设计了针对survivin基因的3条siRNA模板，通过分步酶切连接的办法，将其克隆到pGenesil1载体上，获得了能同时独立表达三个靶向survivin基因的siRNA的重组干扰载体pGenesil1/survivin，经导入U251细胞并采用实时定量PCR以及Western blotting验证干扰效果，结果显示survivin基因的转录和翻译水平均得到明显抑制，提示siRNA成功地沉默了survivin基因的表达. 同时，为研究靶向沉默survivin基因对于人胶质瘤U251细胞凋亡和细胞周期的影响，我们用Annexin V/PI双染法检测凋亡，PI染色检测细胞周期变化. 流式细胞仪分析结果显示，经siRNA作用后，U251细胞发生了显著的凋亡；同时，PI染色的细胞周期检测分析显示，经siRNA作用后的U251细胞周期显著阻滞于G2/M期，提示靶向沉默survivin基因诱导人胶质瘤U251细胞发生了显著的凋亡以及细胞周期阻滞，这与在其他肿瘤细胞系中所做研究报道一致［2-6］；至于沉默survivin基因诱导U251细胞凋亡的机制，推测可能与沉默survivin基因所导致的解除survivin基因对p53基因活性的抑制，以及对caspase家族成员如caspase 3, caspase 7的激活抑制等所导致的细胞凋亡抑制因素减低有关［6-8］，但具体的机制以及与其他肿瘤系中研究结果的异同性，仍有待进一步深入研究.
　　【参考文献】
　　［1］Reynolds A, Leake D, Boese Q, et al. Rational siRNA design for RNA interference ［J］. Nat Biotechnol, 2004,22(3):326-330.
　　［2］Rodel F, Hoffmann J, Distel L, et al. Survivin as a radioresistance factor, and prognostic and therapeutic target for radiotherapy in rectal cancer ［J］. Cancer Res, 2005,65(11):4881-4887.
　　［3］Rich JN, Bigner DD. Development of novel targeted therapies in the treatment of malignant glioma ［J］.  Nat Rev Drug Discov, 2004,3(5):430-446.
　　［4］甄海宁， 章翔， 王西玲，等.  Survivin在2株人脑胶质瘤细胞系中的表达 ［J］. 第四军医大学学报, 2005,26(11):1029-1032.
 
　　［5］Caldas H, Jiang Y, Holloway MP, et al. Survivin splice variants regulate the balance between proliferation and cell death ［J］. Oncogene, 2005,24(12):1994-2007.
　　［6］Hemann MT, Fridman JS, Zilfou JT, et al. An epiallelic series of p53 hypomorphs created by stable RNAi produces distinct tumor phenotypes in vivo ［J］. Nat Genet, 2003,33(3):396-400.
　　［7］Ling X, Bernacki RJ, Brattain MG, et al. Induction of survivin expression by taxol (paclitaxel) is an early event, which is independent of taxolmediated G2/M arrest ［J］. J Biol Chem, 2004,279(15):15196-15203.
　　［8］张剑， 王禾， 秦卫军，等. 前列腺癌Survivin和p53蛋白表达的相关性 ［J］. 第四军医大学学报，2005,26（3）:251-253
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