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| 高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶酶解物对小鼠免疫功能的影响 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-30  |
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【摘要】 目的研究高原鼢鼠肉蛋白的木瓜蛋白酶酶解物生理活性功能，对酶解物进行了免疫活性实验。方法通过MTT法和中性红比色法测定其对小鼠脾淋巴细胞增殖、腹腔巨噬细胞吞噬功能、网状内皮系统吞噬功能、NK细胞杀伤毒性，鼠抗体生成脾细胞数(IgMPFC) 的影响。结果酶解物高、中剂量与对照相比有显著差异，而其中以高剂量组的活性最明显，能够显著提高小鼠淋巴细胞的增殖能力；激活小鼠网状内皮系统，增强吞噬功能；增强NK细胞活性；增加小鼠脾脏的抗体生成细胞数。结论 高原鼢鼠肉蛋白的木瓜蛋白酶酶解物能明显提高正常小鼠细胞免疫、体液免疫及NK细胞杀伤毒性的能力。 【关键词】 高原鼢鼠肉；木瓜蛋白酶； 酶解；免疫功能 Abstract：Objective In order to investigate the physiological funtions of papain digest of Myospalaxbaileyi flesh protein, immune activity experiment was done with the digest. MethodsMTT method and neutral red colorimetric method were applied to measure the effect of the digest on the proliferation of spleen lymphocyte of mice, the phagocytic function of celiac macrophage and reticuloendothelial system, the killing toxicity of NK cells, and the number of splenocyte induced by rat antibody (IgMPFC). ResultsThe groups with high and middle dosage have significant difference from the control group, with the high dosage group showing the most obvious activity. ConclusionThe papain digest of Myospalaxbaileyi flesh protein has a significant promotion effect on the cell and humoral immunity of normal rat as well as the killing and toxicity activity of NK cells. Key words：Myospalax baileyi meat； Papain； Hydrolysis； Immune function 高原鼢鼠Myospalax baileyi是栖息于青藏高原的一种危害草场和农田的数量巨大的地下啮齿动物。据营养成分的分析结果（《四川动物》待发），高原鼢鼠肌肉除含有亚油酸等对人体有益的不饱和脂肪酸外，还有丰富的蛋白质,钙、镁、铁、锌、磷等无机盐和烟酸、核黄素、视黄醇等维生素，是一种营养价值很高的蛋白质资源。近年的研究表明，蛋白质水解为小肽后就可以被人体吸收［1］，而蛋白质水解产物具有蛋白质无法比拟的生理功能和营养价值。近几年对高原鼢鼠肉的研究集中在脂溶性成分抗缺氧机制上［2～5］，目前尚未见对高原鼢鼠肌肉蛋白酶解液免疫功能的相关研究报道。 为了综合开发利用高原鼢鼠资源，变害为宝，提高高原鼢鼠肉蛋白的营养和利用价值，本研究采用酶法水解高原鼢鼠肉，对酶解液的氨基酸成分进行了分析，并针对免疫系统中T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞，进行了T淋巴细胞转化实验、小鼠抗体生成脾细胞数(IgM-PFC)、NK细胞杀伤毒性实验等免疫学实验，探讨高原鼢鼠肉酶解液对小鼠免疫功能的影响。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 材料 高原鼢鼠Myospalax baileyi：捕于四川省阿坝州若尔盖县。 1.1.2 试剂 木瓜蛋白酶5.8×105 U/g，美国Sigma公司产品；RIMP1640培养基，美国GIBCO公司产品；MTT，ConA，LPS；Alsever溶液；Hank's溶液；0.8%戊二醛溶液；1.51%绵羊红细胞悬液。其它试剂：市售，均为分析纯。 1.1.3 动物 昆明种健康成年小鼠，雌雄各半，体重20～22 g，由四川大学华西实验动物中心提供。 1.2 仪器与设备 DS1高速捣碎机(上海标本模型厂)； KMTD500型电热恒温震荡水槽(上海益恒实验仪器有限公司)；LD510型离心机(北京医学仪器厂)； KQ400超声波发生仪(昆山市超声仪器有限公司)；Phs2 c型pH计(上海虹益仪器厂)； 751G型紫外光栅可见分光光度计(上海分析仪器厂)等。 1.3 方法 1.3.1 酶解液制备［6］高原鼢鼠Myospalax baileyi 肉木瓜蛋白酶解液，酶解液100℃煮沸10 min，冷却至室温，以10 000 r/min，离心5 min，收集上清液。残渣再重复提取两次，合并3次的上清液，静置，分去油脂后真空浓缩，真空干燥得酶解高原鼢鼠肉蛋白，密封冷藏。 1.3.2 酶解液氨基酸分析 采用日立83550型氨基酸分析仪进行测定。 1.3.3 脾细胞悬液的制备将上述昆明小鼠40只，随机分为正常组、酶解物大、中、小剂量组，每组10只，连续灌胃7 d，颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取脾，置于盛有无菌 Hank’s液的小平皿中撕碎，在200目不锈钢筛上轻轻研磨过网，用无菌Hank's液洗3次，离心10 min/次(1 000 r/min）。将细胞悬浮于2 mlRIMP1640培养液中，用台盼兰染色检查细胞成活情况，选择成活细胞在95%以上者进行实验。调整细胞浓度为2×105个/Ｌ。 1.3.4 T淋巴细胞转化实验［7］将细胞悬液分两孔加至24孔培养板中，1 ml/孔，一孔加ConA液50 μl(相当于5 mg/ml)，另一孔作为对照，置5%CO2，37℃条件下培养72 h。培养结束前4 h，每孔吸去上清液0.7 ml，加入不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT50 μl/孔(5 mg/ml)，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 ml酸性异丙醇，吹打均匀，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，在波长570 nm处测定吸收度。 1.3.5 对小鼠抗体生成脾细胞数(IgMPFC)的影响： 给药途径、剂量及方法同1.3.3项。处死前5 d，每只小鼠腹腔注射生理盐水配制成的20 ml/L SRBC 0.2 ml(约2×108个)。将经SRBC免疫5 d的小鼠处死，取出脾，放在盛有HankS液的小平皿内，轻轻撕碎脾，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心洗净，将细胞悬浮在5 ml RIMP1640培养液中，调节至细胞浓度为5×106个/ml，取20 μl脾细胞悬液、50 μl含100 ml/L SRBC的SA液及0.5 ml处理的表层琼脂糖培养液，混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入CO2培养箱温育1.0～1.5 h，然后将SA缓冲液稀释的补体(1∶10)加入到玻片架的凹槽内，继续温育1.0～1.5 h，形成肉眼可见的空斑后计数溶血空斑数。测定每5×106个脾细胞产生的空斑数。1.3.6 NK细胞杀伤毒性实验［8］ 用含10%小牛血清的RIMP1640培养液脾细胞悬液配成1×107/ml浓度作为效应细胞；传代培养的L929细胞在实验前1 d换液，实验时用0.25%胰蛋白酶1～2 ml消化1～2 min，加完全RIMP1640培养液，吹打使其完全从壁上脱落，离心去上清，加含小牛血清的培养液，调至浓度为2×105/ml,作为靶细胞;在96孔板内加入靶细胞悬液，每孔0.1 ml，放入37℃，5%CO2孵箱中培养1 h，使其贴壁成单层细胞，然后实验孔加入0.1 ml效应细胞悬液，做4个复孔，靶细胞对照孔加完全RIMP1640培养液0.1 ml；然后将96孔板放在37℃，5%CO2孵箱中孵育20 h，去上清用生理盐水轻轻注满各孔，反复3次，以除去效应细胞和被杀伤脱落的靶细胞，在滤纸上吸干孔内水分；每孔加入0.1 ml的0.1%中性红染液，孵育30 min，弃去染液，用生理盐水洗3遍，每孔加0.1 ml细胞溶解液，使含有中性红的靶细胞溶解，摇匀，用酶标仪测OD值，波长450 nm，用以下公式计算杀伤率。实验数据采用方差分析检验 。 杀伤率(%)=(靶细胞OD值-实验组OD值)靶细胞OD值×100% 2 结果 2.1 水解液的成分分析在以上确定的最佳条件下水解得到的水解液呈淡黄色透明状态，氨基酸分析结果见表1。表1 水解液的游离氨基酸和总氨基酸的分析（略） 2.2 T淋巴细胞转化实验结果见图1。结果显示，与对照组相比，不同剂量组酶解产物对小鼠脾T淋巴细胞增殖活性均有一定影响，存在明显的剂量依赖关系，其中在浓度较低（低剂量组）时，对淋巴细胞增殖活性的调节作用很小，随着添加浓度的增大，作用逐渐明显，当浓度为 0.4 g/ kg（高剂量组）时，增殖作用达到最大，与正常对照组比较 ，差异有显著意义（P＜0.05）。 从表1可见，高原鼢鼠肉蛋白水解液含8种必需氨基酸在内的17种氨基酸，且必需氨基酸占总氨基酸量的46.58%，说明高原鼢鼠肉水解后其必需氨基酸数量充足，组成比例较为合理，符合FAO/WHO建议的人体必需氨基酸模式；E/N=0.92，大于 FAO/WHO推荐的0.6；高原鼢鼠水解液中含有较高量婴幼儿所需的组氨酸和精氨酸，所以高原鼢鼠肉水解液是一种优质蛋白液；由于其中氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸等)的含量较高，占氨基酸总量的26.11%，故水解液味道非常鲜美。 2.3 酶解液对小鼠抗体生成脾细胞数(ＩｇM-PFC)的影响图2显示，各组小鼠脾脏的抗体生成细胞数依次升高，其中，酶解液高剂量组、中剂量组与对照组比较，差异具有显著性意义 (P＜0.05)，说明酶解液具有增强小鼠特异性体液免疫的功能。 图3显示，酶解液低剂量组、酶解液中剂量组、酶解液高剂量组与生理盐水组比较，NK杀伤率均有提高；其中，酶解液低剂量组、酶解液中剂量组、与生理盐水组比较，差异具有显著性意义 (P＜0.05)；酶解液高剂量组与生理盐水组比较，差异具有极显著性意义 (P＜0.01)，说明高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶解液能提高机体免疫力。 3 讨论 高原鼢鼠肉木瓜蛋白酶解产物是氨基酸与多肽的混合物，酶解能改变蛋白质的功能特性，如酶解能大大提高其溶解性；一定程度的水解也能提高其乳化性等，肽作为动物消化道蛋白质的酶解产物，是被迅速吸收的氨基酸供体，能够调节动物体消化、神经、内分泌和免疫等系统的生命活动，这类物质被称为腔内信号分子，随着肽吸收理论为越来越多的人们接受，活性肽在动物蛋白质营养中的作用愈发受到关注，因而有人提出蛋白质的营养是肽的营养。 机体免疫功能特别是细胞免疫功能下降，是导致细菌和病毒感染等发病率高的主要因素，体外淋巴细胞转化实验是目前测定机体细胞免疫功能状态的一种较好的方法［9］。 自然杀伤细胞（NK细胞）是一类重要的免疫调节细胞，是机体细胞免疫功能的组成部分，能非特异性地杀伤靶细胞，参与细胞免疫，在肿瘤免疫、抗病毒感染中也具有重要作用，其介导的细胞毒性作用是肿瘤细胞免疫监视的第一道防线，因而，NK细胞在肿瘤免疫中的作用越来越受到重视，是目前已被公认的免疫监视中最重要的效应细胞。因此，研究生物活性物质对 NK细胞杀伤活性的影响有重要意义。 对T-细胞依赖的抗原SRBC的抗体反应是体液免疫能力的体现，它是免疫力分析中最敏感和最优先的参数［10］，体内对SRBC的抗体反应，是反映了增加抗原细胞、T-细胞、B-细胞之间协同能力的免疫反应。 本实验为了综合开发利用高原鼢鼠资源，探讨高原鼢鼠肉酶解液对小鼠免疫功能的影响，变害为宝，提高高原鼢鼠肉蛋白的营养和利用价值，采用酶法水解高原鼢鼠肉得到的酶解物，针对免疫系统中T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞的免疫学实验。实验表明酶解物具有增强细胞免疫活性、体液免疫活性及NK细胞杀伤毒性的能力。 【参考文献】 |
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