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高效液相色谱法测定黄金咽喉片中甘草酸的含量           ★★★ 【字体：小 大】
高效液相色谱法测定黄金咽喉片中甘草酸的含量
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-30    
 作者：何兵，冯文宇，田吉，李春红，艾洪兵 

【摘要】  目的建立黄金咽喉片中甘草酸的含量测定方法。 方法采用HPLC法测定甘草酸的含量。色谱柱为Dikma Kromasil C18柱（5μm，250 mm×4.6 mm）；流动相甲醇0.2 mol/L醋酸铵-冰醋酸（66∶34∶1）；流速0.8 ml·min-1；检测波长252 nm；柱温40℃；进样量10 μl。结果甘草酸在0.4～4 μg范围内具有良好的线性关系（r＝0.999 9），平均回收率为99.65％，RSD为0.514％（n＝6）。实验测得黄金咽喉片中甘草酸的含量为0.978～1.086 mg/片。结论该方法简便、快速、有效、灵敏、准确、具有良好的重复性和回收率，可作为该制剂的定量分析方法。

【关键词】  高效液相色谱法；黄金咽喉片； 甘草酸

　　Abstract：ObjectiveTo establish a method for the content determination of glycyrrhizic acid in Huangjing Yanhou Tablet．MethodsThe content of glycyrrhizic acid was detected by HPLC. The separation was carried out on a Dikma Kromasil C18 column (5μm，250 mm×4.6 mm) . The mobile phase was methanol-0.2mol/L ammonium acetate-glacialacetic acid（66∶34∶1）. The flow rate was 0.8 ml·min-1. The dectetion wavelength was set at 252nm. The column temperature was 40℃ and  the sample was 10 μl．ResultsThe calibration curve showed good linearity over the range of 0.4～4 μg（r＝0.9999）. The average recovery was 99.65％ with RSD 0.514％（n＝6）. Each tablet contained Glycyrrhizic Acid 0.978～1.086 mg.ConclusionThis method was simple，rapid，efficient，sensitive，accurate and has good repeatability and recovery，it can be used as a quantitative analysis method for this preparation．

　　Key words：HPLC；  Huangjing Yanhou Tablet；  Glycyrrhizic acid

    黄金咽喉片是由金银花、甘草等多味中药的有效部位组成的复方制剂，具有芳香透邪、清热解毒、生津润燥、利咽止痛等功效。主要用于治疗急慢性咽炎、喉炎、扁桃体炎、口腔黏膜溃疡；亦可辅佐治疗细菌或病毒感染的其它呼吸道疾病。为完善制剂的质量标准，在对绿原酸含量采用HPLC测定的基础上，增加了采用HPLC测定方中的另一有效成分甘草酸的含量。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器戴安高效液相色谱仪（P680A四元低压梯度泵，PDA-100二极管阵列检测器，TCC-100柱温箱，Chromeleon色谱工作站）；瑞士Precisa电子天平（XR 205SM-DR）；CQX25-06超声波清洗器（上海必能信超声有限公司，功率250W，频率25kHz）。

　　1.2  对照品甘草酸铵（110731-200409），中国药品生物制品检定所提供。在选定色谱条件分离后，未见其他杂质峰，含量以100 %计。

　　1.3  试药甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯；水为重蒸馏水。

　　1.4  样品黄金咽喉片及阴性对照样品（泸州医学院药学院药物研究所自制）。

　　2  方法与结果

　　2.1  提取条件的选择

　　2.1.1  提取溶剂的选择取重量差异项下的本品20片，精密称定，研细，置称量瓶中备用，取约3.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，再分别精密加入甲醇、50％甲醇、水及流动相50 ml，分别超声60 min，照《中国药典》甘草项下甘草酸含量测定方法［1］测定，测得甘草酸含量分别为：0.896，0.987，0.735，1.086 mg/片。甲醇、50％甲醇和水所提取样品其甘草酸含量均低于流动相所提取的样品，故采用流动相制备供试品溶液。

　　2.1.2  溶剂体积的选择取本品细粉3.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，再分别精密加入流动相25，50，75，100 ml，分别超声60 min，照《中国药典》甘草项下甘草酸含量测定方法测定，测得甘草酸含量分别为：1.028，1.085，1.086，1.086  mg/片。根据测定结果，确定本法提取体积为50 ml。

　　2.1.3  提取时间的选择取本品细粉0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，再分别精密加入流动相50 ml，分别超声提取15，30，45，60 min，照《中国药典》甘草项下甘草酸含量测定方法测定，测得甘草酸含量分别为：0.845，0.987，1.086，1.085 mg/片。可见本法超声45 min即可。

　　2.2  色谱条件的选择

　　2.2.1  检测波长的选择以甘草酸铵对照品、黄金咽喉片样品、阴性对照样品溶液进样，采用二极管阵列检测器在190～380 nm范围内分别扫描其甘草酸的紫外吸收图谱，见图1。对照品和样品中的甘草酸最大吸收峰均在252 nm附近，在此波长下，阴性对照在甘草酸对应峰处无吸收，故检测波长选择252 nm。

　　2.2.2  色谱柱的选择实验中考察了大连物理化学研究所 Lichrosorb C18（10 μm，200 mm×4.6 mm）、Dikma Kromasil C18 （5 μm，250 mm×4.6 mm）、Dikma Kromasil C18 （5 μm，150 mm×4.6 mm），以Dikma Kromasil C18 （5 μm，250 mm×4.6 mm）色谱柱的分离效果最佳，故选择Dikma Kromasil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）色谱柱。

　　2.2.3  流动相的选择实验过程中首先考察了2005版《中国药典》Ⅰ部甘草项下测甘草酸含量的条件，即：甲醇∶0.2 mol/L醋酸铵溶液∶冰醋酸（67∶33∶1），但甘草酸峰后有一小峰紧随其后，为达到更好的分离效果，将甲醇比例约降低，改为66∶34∶1，同时升高温度，将甘草酸峰保留时间稍提前，即：流动相为甲醇∶0.2 mol/L醋酸铵溶液∶冰醋酸（66∶34∶1），柱温为40℃，流速为0.8 ml·min-1，在此条件下甘草酸峰与其后面的小峰分离度为4.06，分离效果提高。

　　2.2.4  色谱条件色谱柱：Dikma Kromasil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：甲醇-0.2 mol/L醋酸铵-冰醋酸（66∶34∶1）；检测波长252 nm；柱温40℃；流速0.8 ml·min-1；进样量10 μl。

　　2.3  试液的制备

　　2.3.1  对照品溶液的制备 
　　取经五氧化二磷减压干燥至恒重的甘草酸铵对照品适量，精密称定，加流动相制成每毫升含0.2 mg的溶液（折合为甘草酸每毫升含0.1959 mg）即得。

　　2.3.2  供试品溶液的制备
 
　　取重量差异项下的本品20片，精密称定，研细，置称量瓶中备用，取约3.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相50 ml，称定重量，超声处理（功率250W，频率25kHz）45 min，放冷，再称定重量，用流动相补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.3.3  阴性对照溶液的制备

　　取按处方比例及制备工艺制得不含甘草提取物的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

　　2.4  系统适应性实验
 
　　分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、缺甘草提取物的阴性对照溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图2～4。从图中可见，甘草酸的保留时间为10.3 min左右，阴性对照在甘草酸峰处无干扰，即本实验条件下甘草酸与其它组分分离完全，与其前后色谱峰的分离度分别为2.13，4.00，拖尾因子为0.97，理论塔板数以甘草酸峰计为7 555。

　　2.5  线性关系考察分别精密吸取甘草酸铵对照品溶液（0.2 mg·ml-1）2，4，6，8，10，15，20 μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积值A对进样量C（μg）进行回归，得标准曲线方程：A＝15.612 1C + 0.116 3，r＝0.999 9。结果表明，甘草酸在0.4～4 μg范围内，峰面积值与进样量有良好的线性关系。

　　2.6  精密度实验 

　　精密吸取同一供试品（批号030508）溶液10 μl，按上述色谱条件连续进样5次，甘草酸峰面积分别为：19.803 0，19.821 6，19.816 3，19.842 5，19.834 2，平均值为：19.823 5，RSD为0.078％。表明仪器精密度良好。

　　2.7  稳定性实验 

　　取新鲜配制的本品(批号：030508)供试品溶液，室温下放置，分别在0，2，4，6，8，10，12，24，36 h精密进样10 μl，甘草酸的峰面积分别为：19.8639，19.8572，19.8548，19.8534，19.8496，19.8512，19.8413，19.8278，19.7926。平均值为：19.7926，RSD为0.109％，表明供试品溶液在36 h内稳定。

　　2.8  重复性实验 

　　取同一批号样品（批号030508），按供试品溶液的制备方法，制得5份供试品溶液，分别精密进样10 μl，测得甘草酸的含量分别为：1.0852，1.0864，1.0835，1.0849，1.0868 mg/片，平均含量为1.0854 mg/片，RSD为：0.121％。表明本方法重现性良好。

　　2.9  加样回收实验 

　　精密称取已知含量（0.206 3％）的本品（批号：030508）细粉3.0 g数份，分别精密添加甘草酸铵对照品贮备液（0.512 mg/ml）适量，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，并计算回收率。结果见表1。实验结果表明，本法具有良好的回收率。表1  样品回收率实验测定结果（略）

　　2.10  样品测定 

　　分别精密量取对照品溶液和供试品溶液10 μl，按上述色谱条件测定并计算甘草酸的含量。结果见表2。表2  黄金咽喉片中甘草酸含量测定结果（略）

    根据上述测定结果，考虑到甘草的原料来源、贮藏、制剂生产等因素，暂定本品每片中甘草酸的含量应为0.8～1.2 mg。

　　3  讨论

　　3.1  由于甘草酸不容易结晶，其对照品很难得到，而甘草酸铵容易结晶，易得到纯品，在酸性流动相体系中，仍以甘草酸形式存在，二者分子量之比为0.979 7，不影响测定及结果计算［2］，故可以用甘草酸铵作为测定制剂中甘草酸含量的对照品。

　　3.2  黄金咽喉片中的主要有效成分为绿原酸、甘草酸等，在对绿原酸含量测定的基础上增加甘草酸的含量测定，对控制该制剂的质量是非常必要的。实验采用HPLC测定黄金咽喉片中甘草酸的含量，结果准确可靠，精密度重复性好，可用于该制剂中甘草酸的质量控制。   

　　3.3  黄金咽喉片是以有效成分计量组方投料，同时规定了有效成分甘草酸的含量范围（0.8～1.2 mg/片），主要是为了确保产品质量稳定可控。否则，若以药材量组方投料，同时规定有效成分含量的一个下限值，容易出现同一种药有效成分含量差别太大，从而导致疗效的不一致。

 

【参考文献】
  　　［1］国家药典委员会．中国药典,Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：59.

　　［2］孙文基，谢世昌．天然药物成分定量分析［M］.北京：中国医药科技出版社，2003：205.
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