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几种金银花的高效液相色谱法鉴别与系统聚类分析           ★★★ 【字体：小 大】
几种金银花的高效液相色谱法鉴别与系统聚类分析
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-4    
作者：赵惠茹，王锐平，路平，魏彩霞，王燕 
【关键词】金银花；高效液相色谱；系统聚类分析 
　　摘要：目的鉴别17种金银花的质量。方法采用高效液相色谱法对样品进行分析，获得反映样品整体化学特征的数据，利用聚类分析进行分类。结果在选定的色谱条件下，建立了稳定可控的药材高效液相色谱图，系统聚类法可将样品有效地分类。结论该方法鉴别金银花是可行的，能为其质量评价提供有用的信息。 
　　关键词：金银花；高效液相色谱；系统聚类分析 
　　金银花始载于《名医别录》，历代本草均有记载。2005年版《中国药典》收载的种类为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花［1］。其作为常用中药，具有清热解毒、疏散风热的功效。在临床上广泛用于急性热病及外科感染性疾病。该药材植物来源复杂，在全国几乎都有分布。据文献［2,3］报道，目前市售金银花商品十分混乱，有47余种植物的花蕾在各地均被当作金银花入药，如不加以区别，便会影响临床疗效。针对这一客观存在的问题，本文对不同来源的17种金银花样品的化学成分进行了HPLC分析，由此获得金银花的化学信息，应用系统聚类分析的方法进行分类，为制定综合评价金银花质量的新方法进行了探索。近年来，系统聚类方法［4，5］越来越多地应用于中药材鉴别与分析领域，这是利用数学手段对一群事物按其“属性”进行分类的方法。它作为一种特定的方法，从数据分析的角度给出了一个更准确、细致的分类工具。本文即用此法对金银花进行了研究，结果准确可靠，为中药金银花的正、伪品鉴别分析提供了一种新的方法。 
　　1仪器与材料 
　　1.1仪器Agilent1100高效液相色谱仪（脱气机、四元泵、紫外检测器、柱温箱、HPChemstations工作站）；KQ-50型超声波清洗器（昆山市超声波仪器厂）。 
　　1.2试药绿原酸对照品和金银花对照药材（中国药品生物制品检定所），乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，三蒸水（自制）。金银花样品分别购自各地药材公司，经本院天然药物教研室鉴定，其来源及编号见表1。 
　　2方法 
　　2.1色谱条件YGW-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：A液乙腈，B液0.5%磷酸水溶液，梯度洗脱（0~12min：乙腈∶5%~15%，12~20min：乙腈∶15%~25%，20~30min：乙腈∶25%~30%，30~40min：乙腈∶30%~5%）；流速：1.0ml・min-1；检测波长：327nm；进样量：20μl；柱温：25℃。 
　　表1样本来源与编号（略） 
　　2.2绿原酸对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品1.0mg，用乙腈0.5%磷酸水溶液（5∶95）定容至10ml，配成0.1000mg・ml-1的原液备用。 
　　2.3金银花药材对照品的制备精密称取金银花药材对照品100mg，用乙腈0.5%磷酸水溶液（5∶95）定容至10ml，超声提取30min后过滤，滤液作为药材对照品溶液备用。 
　　2.4供试品溶液的制备将以上各金银花样品干燥后粉碎，过60目筛，精密称取各样品粉末100mg，用乙腈0.5%磷酸水溶液（5∶95）定容至10ml，超声提取30min后过滤，滤液作为样品溶液备用。 
　　2.5方法学考察 
　　2.5.1稳定性实验取同一份供试品溶液（金银花药材2），分别在0，2，4，8，16，24h检测，其相对保留时间RSD均小于3%，主要峰面积RSD小于5%，说明溶液至少在24h内稳定。 
　　2.5.2精密度实验取同一份供试品溶液（金银花药材2），连续进样5次，考察色谱峰的相对保留时间和主要峰面积比值的一致性。结果各色谱峰的相对保留时间和主要峰面积比值的RSD均小于3%，说明精密度良好。2.5.3重复性实验取金银花药材2供试品5份，同法检测，考察色谱峰相对保留时间和主要峰面积比值的一致性。结果各色谱峰的相对保留时间和主要峰面积比值的RSD均小于2%，说明分析方法重复性符合要求。 
　　2.6测定法取金银花药材对照品溶液和供试品溶液按照2.1项下色谱条件进样分析，得到金银花对照药材的高效液相色谱图（见图1）和17批样品的高效液相色谱图。同时用绿原酸对照品溶液同体积进样分析，确定绿原酸的出峰时间。以金银花对照药材中各色谱峰的总面积为分母，样品中各个色谱峰面积为分子，计算该色谱峰的相对峰面积值。结果见表2。 
　　5-绿原酸  www.lunwenwang.com 论文网在线
　　图1金银花药材对照品的高效液相色谱图（略） 
　　表2样本中各峰的相对峰面积（略） 
　　3结果 
　　应用SPSS10.0统计软件对获得的HPLC数量化特征进行系统聚类分析，结果见图2。 
　　图217种金银花的系统聚类分析（略） 
　　4讨论 
　　4.1按本实验拟定的方法，测定了17批金银花样品的高效液相色谱图，选择其中峰面积最大的8个峰排列成表，并结合各色谱峰在17批样品中出现的频率，共标出12个共有峰，总共有峰峰面积含量在85.92%~91.46%之间，各批样品间主要共有峰的相对保留时间亦较稳定，峰值比例较典型。以12个共有峰作为聚类分析的指标，精密度、稳定性、重复性实验良好，因此，可初步拟定为金银花乙腈提取物成分的指标成分群。 
　　4.2本实验比较了等度洗脱和梯度洗脱对金银花高效液相色谱图的影响，结果发现等度洗脱时，改变流动相的组成或比例只能得到较少的色谱峰，而改用梯度洗脱，则可得到金银花药材所含组分的大量信息，样品中不同极性的组分均获得了相对稳定的峰形和峰面积，且基线较平稳，保留时间适宜，分离效果较好。 
　　4.3由聚类分析结果可以看出，样品1~10，16，17号聚为一类，它们分别来源于忍冬和山银花，样品12，14，15号与样品11，13号首先分别各自聚为一类，然后再共聚为一大类，它们分别为金银花的各地常见代用品。可见，在本文的色谱实验和聚类分析参数条件下，金银花正品与各地代用品的分类鉴别效果比较明显。但是8种正品金银花之间的鉴别效果并不甚理想，且缺乏量化指标，其原因是否与产地和生长环境有关，尚待实验研究。 
　　4.4目前，金银花的鉴别和分类很大程度上还依赖于经验和表观分析，缺乏从分析数据中获取依据的方法。本实验基于金银花高效液相色谱图整体面貌的共性特征，选取了包括绿原酸在内的12个特征峰，获得了相对峰面积值，用系统聚类分析的方法对金银花的质量做出了较全面、准确地评价，具有数学概念简单、数据处理比较简便、快速等特点，能有效地将正品与代用品分开。 
　　参考文献： 
　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2005：152. 
　　［2］石钺,石任兵,陆蕴如.我国药用金银花资源及药理研究进展［J］.中国中药杂志,1999,34(11):724. 
　　［3］于生兰,张龙,孙玲.金银花的研究进展［J］.时珍国医国药,2002,13(8):498. 
　　［4］庄恒扬,沈新平,陆建飞,等.模糊聚类计算方法的理论分析［J］.江苏农学院学报,1998,19(3):37. 
　　［5］谢季坚,刘承平.模糊数学方法及其应用［M］.武汉:华中科技大学出版社,2001：58.
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