【关键词】葛根芩连汤；,,指纹图谱；,,上清液；,,沉淀

　　摘要：目的通过应用三维高效液相色谱，建立葛根芩连汤上清液和沉淀中异黄酮指纹图谱的方法，明确其上清液和沉淀中异黄酮类成分的异同，以便进一步探讨该方的配伍规律。方法葛根素、大豆苷元用甲醇溶解制成对照品溶液，葛根药材水煎液、葛根芩连汤上清液、沉淀用二甲基亚砜溶解制成供试品溶液，采用三维高效液相谱对葛根芩连制剂进行指纹图谱实验研究，流动相为甲醇水乙腈梯度洗脱，扫描波长为200～400nm。结果在梯度洗脱条件下，葛根芩连汤上清液的HPLC指纹图谱中有6个标识性共有峰，葛根芩连汤沉淀的HPLC指纹图谱中有4个标识性共有峰。但峰面积仅占上清液的8%（以葛根素计）。结论葛根芩连汤配伍产生的沉淀中亦有异黄酮类有效部位，但与上清液比较，含量较低。说明君药葛根中异黄酮类成分与方剂中的其他物质络合而产生沉淀，且该沉淀溶于二甲基亚砜。

　　关键词：葛根芩连汤；指纹图谱；上清液；沉淀

　　葛根芩连汤原载于东汉张仲景《伤寒论》中，由葛根、黄芩、黄连、炙甘草4味中药组成。其处方为：葛根15g，黄芩9g，黄连9g，甘草(炙)6g。其中葛根为君药，黄芩、黄连为臣药，炙甘草为使药。功效主要是表里双解，清热止痢。中药配伍在煎煮过程中，其成分发生复杂的变化，其中沉淀反应是中药配伍共煎时常见的变化。日本学者于1978年首次报道黄连配伍甘草、大黄时小檗碱等生物碱在煎剂中的含量大幅度下降［1］。其沉淀能溶于二甲基亚砜，部分溶于吡啶、稀酸、稀碱，微溶于冷甲醇、乙醇，不溶于氯仿、石油醚、在热甲醇中能不断溶解，冷后又生成沉淀［2］。沉淀使煎液中有效成分的含量降低，且有研究表明，黄连黄芩配伍产生的沉淀，能够在胃肠内溶解［3］，但葛根芩连汤配伍后究竟是哪些成分发生沉淀反应，目前尚未有明确的结论。本实验试图通过指纹图谱的方法，探明其上清液与沉淀中异黄酮成分的异同，以明确沉淀物中是否有异黄酮类成分。

　　1仪器与试药　

　　美国惠普HP1100高效液相色谱仪，G1315A紫外可见光二级管阵列检测器，离心机（北京医用离心机厂），甲醇(分析纯，天津大茂学试剂厂)、甲醇（色谱纯，MERCK)，乙腈(色谱纯)，葛根素对照品753200007、大豆苷元对照品1502200101(中国药品生物制品检定所)；葛根、黄芩、黄连、甘草药材由广东省致信药材公司提供,经本校中药鉴定教研室刘传明讲师鉴定,分别为豆科植物野葛PuerarialobataOhwi,唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi干燥根茎,毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.干燥根茎,豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.干燥根茎(蜜炙)。

　　2方法

　　2.1葛根芩连汤标准汤剂供试品溶剂的制备葛根15g，黄芩9g，黄连9g，甘草6g，烧杯中加水400ml,先煎葛根20min,余药共煎30min,煎两次,趁热120目滤布滤过,合并滤液。90℃定容至1000ml,静置室温后，于冰箱4℃内静置24h，取出，离心以3000r/min，得到上清液，定容到1000ml，为供试品溶液1；沉淀于烘箱内50℃干燥24h后，加适量二甲基亚砜使溶解，定容到1000ml，过滤，得供试品溶液2。

　　2.2色谱条件甲醇∶水∶乙腈梯度洗脱［4，5］检测波长的选择。结果见表1。依据DAD检测的三维图谱,选择可将全谱物质均能检测到的250nm作为最后的检测波长(图1～3)。

　　表1梯度洗脱条件（略）

　　图1葛根药材水煎液（略）

　　图2葛根全方上清液（略）

　　图3葛根芩连全方沉淀（略）

　　2.3对照溶液的制备

　　2.3.1对照药材溶液的制备取葛根药材15.09g，水煎煮2次，煎煮时间分别为30，20min，滤过，煎煮液定容到1000ml，即得。

　　2.3.2对照品溶液的制备精密称取葛根素、大豆苷元各5mg，于50ml容量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，即得。 www.lunwenwang.com 论文网在线

　　2.4样品测定精密吸取各溶液10μl，注入高效液相色谱仪（HPLC）中，参照高效液相色谱法，结合指纹图谱的要求进行实验，以对照药材为参照色谱，测定并记录色谱图，以中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版采用多点校正的方法进行计算分析。

　　2.5对照实验吸取对照品溶液10μl，注入HPLC，得知21.5min左右的峰为葛根素，40min左右为大豆苷元。

2.6精密度实验取对照药材溶液连续进样6次，测得峰共有15个，其中6个共有峰相对保留时间RSD小于1%，其共有峰的峰面积占总峰面积的78%～83%，各谱图相似度为0.999。结果见图4。

　　图4对照药材指纹色谱图（略）

　　2.7重复性实验平行做6份汤剂，同供试品1的制备方法，测定，测得峰共有18个，其中6个主要峰保留时间RSD小于1%，共有峰占总峰面积的56%～62%，各谱图相似度为0.992～0.995，表明其重复性实验较好。结果见图5。

　　图5葛根芩连汤上清液重复性考察指纹色谱图（略）

　　2.8稳定性实验取供试品溶液1，分别在0，2，4，6，8，12，24h，测得其中6个主要峰保留时间RSD小于2%，共有峰占总峰面积的55%～67%，各共有各谱图相似度为0.989～0.997，表明样品溶液在24h内稳定。结果见图6。

　　图6葛根芩连汤上清液稳定性考察指纹色谱图（略）

　　3结果

　　葛根药材水煎液中在250nm左右有最大吸收的物质有6种，其紫外吸收行为如图1，指纹图谱见图7，葛根芩连全方水煎液的上清液中最大吸收为250nm的主要吸收峰的紫外吸收行为见图1，指纹图谱见图8，葛根芩连全方沉淀中最大吸收在250nm附近的主要吸收峰，其紫外吸收行为见图3，沉淀的指纹图谱见图9。

　　图7葛根药材水煎指纹图谱（略）

　　图8葛根全方上清液指纹图谱（略）

　　图9葛根芩连全方沉淀指纹图谱（略）

　　4讨论

　　由图7～9指纹图谱可以看出，葛根芩连全方上清液与葛根水煎药材均具有特征性色谱1～6号峰，而葛根芩连全方沉淀中仅有3～6号峰，上清液中1号峰、2号峰、5号峰在所有峰中所占组分较药材中高（以葛根素为1计），4号峰较药材中低，6号峰两者含量相当。从总体上讲，上清液与沉淀中葛根素含量之和与药材单煎的含量相当。沉淀产生的原因可能是由于黄连中生物碱类成分为碱性，而葛根中的异黄酮类成分呈酸性，全方煎液为酸性，可能由于煎煮过程中pH值的改变而产生沉淀。黄连中的小檗碱、巴马丁、药根碱、黄连碱均为季铵碱，其结构中的氮原子以离子状态存在，同时含有以负离子形式存在的羟基，而葛根中的葛根素具有7位酚羟基，大豆苷元具有4’位酚羟基［6］，可能与氮离子络合形成络合物。本实验结果表明，配伍后葛根也与方剂中其他药物发生沉淀反应，产生的沉淀中存在异黄酮类成分，但含量较低，可能是因为全方制剂中含有黄芩黄酮类、甘草酸类成分，三者存在竞争机制，其具体机制有待于进一步探讨，在制备成方制剂的过程中，不能够简单将沉淀抛弃处理。

　　参考文献：

　　［1］野口卫.汉方制剂分析技术(胡宝华译)［M］.北京：人民卫生出版社，1986：39.

　　［2］齐粱，彭嘉柔，濮训生，等.黄连一黄芩药对煎煮液沉淀物的分析［J］.中国中药杂志，1999，24（6）：352.

　　［3］任谦，李建荣，张广平，等.泻心汤沉淀物在人工胃肠液中溶解情况的研究［J］.中国实验方剂学杂志,2005，11（2）：21.

　　［4］谢培山.中药色谱指纹图谱［M］.北京：人民卫生出版社，2005：322.

　　［5］戴开金，罗佳波，谭晓梅，等葛根芩连汤不同配伍对葛根素含量的影响［J］.中草药，2003，34（6）：506.

　　［6］肖崇厚.中药化学［M］.上海：上海科学技术出版社，1994：272.