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HO-1对抗汞引起的肾细胞凋亡           ★★★ 【字体：小 大】
HO-1对抗汞引起的肾细胞凋亡
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-4    
作者：张英，陈蓉，王顺蓉，曾维诚

【摘要】  目的 探讨血红素氧合酶-1（HO-1）对汞引起肾细胞凋亡的影响及其可能的机制。方法 64只雄性Wistar 大鼠随机分为对照组、单纯染汞组、HO-1诱导组和HO-1抑制组，每组16只。先分别腹腔注射生理盐水、空白液、血晶素、锌原卟啉Ⅸ（ZnPPⅨ）预处理，8 h后处死各组内半数鼠取肾查HO-1表达水平与活性，余鼠除对照组注射生理盐水外，其余3组均腹腔注射HgCl2（2 mg·kg-1），24 h后检测血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）及肾内总抗氧化能力（TAOC）、丙二醛（MDA）、Bcl-2蛋白表达水平与细胞凋亡指数（AI）。结果 与对照组比较，单纯染汞组TAOC降低而MDA、Cr、BUN、Bcl-2表达水平和AI均明显增加（ P <0.01），HO-1抑制组除Bcl-2表达受抑外，其余指标的变化与单纯染汞组相似，但更为显著。HO-1诱导组与单纯染汞组及HO - 1抑制组比较，TAOC及Bcl-2表达均显著升高，而MDA、Cr、BUN及AI则明显降低（均 P <0.01）。结论 HO-1通过抗氧化、上调Bcl -2蛋白表达水平而对抗汞引起肾细胞凋亡的作用。
【关键词】  血红素氧合酶-1;肾;汞;凋亡;大鼠
　　氯化汞（HgCl2）是一种肾毒性药物，常用于制作急性肾功能衰竭的动物模型。近年研究揭示，汞能促  进细胞线粒体产生大量H2O2等活性氧，后者进一步诱导的细胞凋亡在汞所致的急性肾衰中起着重要作用［1-2］。血红素氧合酶-1（HO-1）是一种抗氧化酶，广泛参与各种组织细胞应对氧化应激时的防御机制，是机体拮抗氧化应激损伤最重要的内源性保护物质，但HO-1能否抑制汞介导的肾细胞凋亡及急性肾损伤罕见报道。为此，我们拟应用血晶素与锌原卟啉Ⅸ（Zn-PPⅨ）分别特异性诱导与抑制HO-1，以探明HO-1对HgCl2引起大鼠肾细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。  
 
　　1 材料与方法  
　　1.1 药品与试剂
　　血晶素、ZnPPⅨ为Sigma公司产品。肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（TAOC）、兔抗鼠多克隆HO-1 IgG抗体及Bcl-2 IgG抗体、SABC免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂等均购自武汉博士德生物工程有限公司。TUNEL法凋  亡检测试剂盒购于Boehringer公司，其它试剂均为分析纯。 
　　1.2 动物分组与标本采集
　　选用健康雄性Wistar大鼠64只（体重250～310g），随机分为4组:对照组、单纯染汞组、HO-1诱导组  和HO-1抑制组，每组16只。预先分别给各组大鼠腹  腔注射等量生理盐水、空白液（由0.1 mmol·L-1NaOH和0.1 mmol·L-1PBS液按体积比1∶24配制而  成的混合溶液）、溶于空白液中的血晶素（30 mg·kg-1）及   ZnPPⅨ（20 mg·kg-1），8 h后，每组均任挑8只处  死，取肾脏，一部分肾置于4%的中性甲醛液中固定作HO-1免疫组化染色，其余部分于-80 ℃保存待测HO-1活性。余鼠除对照组经腹腔注射等量生理盐水外，其余3组均经腹腔注射HgCl2（2 mg·kg-1）溶液，动物自由进食饮水，24 h后各组大鼠经2%戌巴比妥钠  40 mg · kg-1腹腔注射麻醉，开腹经下腔静脉抽血检测肌酐（Cr）、尿素氮（BUN），然后迅速摘出肾脏，取部分  肾组织置于4%的中性甲醛液中固定，剩余肾组织于-  80℃保存待测各项生化指标。   
　　1.3 免疫组化检测
　　取上述甲醛液固定肾组织，常规石蜡包埋切片（厚  6 μm），二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，于1g·L-1TBS中微波修复抗原10 min，再置于3%H2O2中15 min，灭活  内源性酶，PBS液反复冲洗3次，采用SABC法按试剂盒说明书分别滴加HO-1或Bcl-2抗体（抗体滴度均为1∶200），DAB显色，封片，400倍镜下随机选择5个不  重叠视野观察肾小管上皮细胞，胞浆见棕色颗粒者为阳性染色细胞。HO-1蛋白表达量采用CD-8病理彩色图像分析系统测定平均光密度值表示，Bcl-2蛋白表达量采用阳性染色指数（PI）表示，PI（%）=阳性染色细胞数/视野内所有细胞数×100%。
 
　　1.4 生化指标检测
　　血Cr、BUN分别采用苦味酸法和二乙酰法，按试剂盒说明书测定。肾组织TAOC和MDA采用化学比色法，操作按试剂盒说明书进行。另取各肾组织标本约0.5 g，加蔗糖Tris缓冲液制成组织匀浆，差速离心法分离微粒体，考马亮蓝法测定蛋白浓度，根据HO   -   1降解血红素生成胆红素的原理，参照何洁［3］的方法测定HO- 1活性，以1 mg蛋白1 h催化血红红蛋白降解生成胆红素的量表示肾组织HO-1活性（ n mol·mg-1·h-1）。 
　　1.5 TUNEL法检测细胞凋亡
　　肾组织经4%中性甲醛液固定过夜，脱水，透明，石蜡包埋，切片（厚6 μm），置于包被有多聚赖氨酸的载玻片上，严格按试剂盒说明书进行操作，最后用苏木素复染细胞核，400倍光镜下观察，胞核染成棕黄色者为凋亡细胞，每张切片选10个不重叠视野，每个视野连  续计数100个肾小管上皮细胞，以凋亡细胞所占的百分比作为凋亡指数（AI）。 
 
　　1.6 统计学分析
　　所得数据均为计量资料，以x-±s 表示，组间比较采用 F及q 检验，应用SPSS 11.5软件进行统计分析。  
　　2 结  果  
　　2.1 肾组织内HO-1蛋白表达与活性
　　免疫组化染色显示，仅HO-1诱导组出现HO-1明显表达，主要定位于肾小管上皮细胞的胞浆中，表现为肾小管上皮细胞胞浆普遍被染成棕褐色，对应的HO-1活性也显著升高。而其余3组肾内HO-1表达较少，染色极浅，对应的HO-1活性也较低，其中HO-1  抑制组HO-1活性显著降低。组间比较见表1。表1 各组HO-1蛋白表达与活性水平比较（略）
　　2.2 肾组织及血生化指标检测结果
　　与对照组比较，单纯染汞组及HO-1抑制组TAOC降低而MDA、Cr、BUN均明显升高，HO-1诱导组则TAOC明显升高（P<0.01），MDA、Cr、BUN 虽有升高趋势，但无显著性差异（P>0.05）。与单纯染汞组比较，HO-1诱导组TAOC明显升高，而MDA、Cr、BUN均显著下降，HO-1 抑制组则相反，TAOC明显下降，而MDA、Cr、BUN均显著升高。HO-1诱导组与HO-1抑制组间各指标均有显著性差异（均 P <0.01）。见表2。表2 各组血生化检测结果比较（略）

　2.3 Bcl-2蛋白表达
 
　　对照组肾内几乎不表达Bcl-2，单纯染汞组Bcl-2阳性染色细胞在近曲小管较常见，远曲小管相对较少，HO-1诱导组肾小管Bcl -2阳性染色细胞显著增多，而HO-1抑制组肾小管Bcl-2阳性染色细胞则较少，各组间比较见表3。表3 各组Bcl-2蛋白表达及细胞凋亡情况比较  （略）
　　2.4 细胞凋亡检测结果
　　对照组肾内凋亡细胞数少见。单纯染汞组见凋亡细胞，主要为近曲小管上皮细胞出现凋亡，与之相比较，HO-1诱导组细胞凋亡明显减少，而HO-1抑制组  细胞凋亡则显著增多，组间比较见表3。 
　　3 讨  论  
　　肾脏是无机汞攻击的主要靶器官，但汞致肾损伤的确切分子机制尚未完全阐明。已有研究显示，给予HgCl2 能够显著增加肾内H2O2等活性氧生成［4］，降低肾内重要抗氧化剂谷胱甘肽的含量，并降低肾内超氧化物歧化酶的活力，同时生成过量的脂质过氧化产物丙二醛［5-6］。当给予外源性抗氧化剂或自由基清除剂，则可明显减轻HgCl2 所致的肾损伤，从而提示促氧化应激是汞致急性肾损伤的重要机制［5］，进一步研究发现，活性氧除直接引起生物膜脂质过氧化导致细胞不可逆损伤外，还可通过激活P  38 MAPK等多途径介导细胞凋亡［7］。本研究结果也显示，单纯染汞组较对照组肾内TAOC显著降低，MDA生成增多，出现肾小管  上皮细胞凋亡增加和肾功能降低，从而证实了HgCl 2 的氧化应激性肾损伤机制。HO-1是近年倍受重视的细胞内源性抗氧化酶，本质上属于应激蛋白，能在各种氧化应激状态下出现适应性表达，发挥抗氧化等多种细胞保护作用。HO-1的抗氧化性源于其对促氧化的游离血红素的降解及生成具有强大抗氧化能力的胆红素，后者能非特异性清除多种自由基［8］。本研究结果显示，预先应用血晶素诱导HO-1蛋白表达及活性升高后，可明显升高肾组织TAOC，降低MDA生成，抑制细胞凋亡并改善肾功能，而预先抑制HO -1蛋白的活性，则会加重汞所致的氧化应激损伤，增加细胞凋亡  并使肾功能恶化，从而支持抗氧化作用是HO-1抗汞所致细胞凋亡和肾功能损伤的重要机制。
     
　　曹秉振等［9］报道，汞可能通过下调Bcl-2蛋白表达、激活caspase-3，从而引起大鼠小脑颗粒细胞凋亡。本研究中，我们也对肾组织内Bcl-2的变化作了检测，结果显示，预先诱导HO-1蛋白表达可以显著上调肾内Bcl-2表达，反之，抑制HO-1表达则下调Bcl-2表达水平。Bcl-2是迄今发现最重要的抗凋亡蛋白之一，  主要通过抑制Bax的促凋亡作用、维持细胞钙稳定、抑制细胞色素C进入细胞浆等，最终抑制由凋亡蛋白酶（caspase）激活所介导的细胞凋亡［10］。因此，HO-1上调Bcl-2表达水平可能是其抗汞致肾细胞凋亡的另一重要机制，至于HO-1如何上调Bcl-2表达尚不清楚。文献资料提示，HO-1通过降解血红素生成的另一重要产物CO可能是其抗细胞凋亡作用的重要执行者［11］。
 
【参考文献】
  　　［1］Carranza-Rosales P，Said-Fernandez S，Sepulveda-Saavedra J. Morphologic and functional alterations induced by low doses of mercuric chloride in the kidney OK cell line:ultrastructur-al evidence for an apoptotic mechanism of damage［J］.Toxi-cology，2005，210（2-3）:111-121.

　　［2］Basnakian A G.Kaushal G P，Shah S V，et al.Apoptoctic pathways of oxidative damage to tubular epitheclial cells［J］. Antioxid Redox Signal，2002，4（6）:915-924.

　　［3］何洁，张敏，刘俊昌，等.血红素氧化酶-1在离体大鼠心肌缺血预处理中的作用［J］.中国病理生理杂志，2001，17（10）: 932-934.

　　［4］Nath K A，Croatt A J，Likely S，et al.Renal oxidant injury and oxidant response induced by mercury［J］.Kidney Int，1996，50（3）:1032-1043.

　　［5］Sener G，Sehirli A O，Ayanoglu-Dulger G.Melatonin protects against mercury（II）-induced oxidative tissue damage in rats ［J］.Pharmacol Toxicol，2003，93（6）:290-296.

　　［6］Shimojo N，Kumagai Y，Nagafune J.Difference between kid-ney and liver in decreased manganese superoxide dismutase activity caused by exposure of mice to mercuric chloride［J］. Arch Toxicol，2002，76（7）:383-387.

　　［7］Donnahoo K K，Shames B D，Harken A H，et al.Review arti-cle:the role of tumor necrosis factor in renal ischemia-reper-fusion injury［J］.J Urol，1999，162（1）:196-203.

　　［8］Takahashi T，Morita K，Akagi R，et al.Heme oxygenase-1:a novel therapeutic target in oxidative tissue injuries［J］.Curr Med Chem，2004，11（12）:1545 - 1561.

　　［9］曹秉振，田辉，常高峰，等.大鼠汞中毒时小脑颗粒细胞凋亡与半胱氨酸蛋白酶-3及Bcl-2的关系［J］.临床神经病学杂 志，2004，17（5）:348-350.

　　［10］金惠铭.病理生理学［M］.第5版.北京:人民卫生出版社， 2000:182.［11］Brouard S，Otterbein L E，Anrather J，et al.Carbon monox-ide generated by heme oxygenase 1 suppresses endothelial cell apoptosis［J］.Exp Med，2000，192（7）:1015-1026
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