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BCP/HAFG-rhBMP-2复合人工骨修复骨缺损的实验研究 | |||||
作者:佚名 论文来源:本站原创 点击数: 更新时间:2008-10-4 | |||||
【关键词】 骨和骨组织;骨移植;生物力学 为寻找理想的人工骨组织材料,本实验将多孔双 相钙磷陶瓷(BCP)同重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)/透明质酸钠(HA)和纤维蛋白复合凝胶(HAFG)缓释体系结合,制成BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨材料,进行修复长骨大段骨缺损的实验。 1 材料与方法 1.1 人工骨材料的制备 (1)BCP由东南大学材料科学与工程学院生物材 料研究组研制提供。该BCP材料呈白色多孔状结构, 孔道彼此连通,孔径约为300 μm,孔隙率为80%。试 验中将BCP制成长10 mm,直径4 mm圆柱体。 (2)BCP/HAFG-rhBMP-2人工骨的制备:在BCP植入前 用特制双管注射器将混有等量rhBMP-2 的HAFG复合凝胶缓慢滴注入BCP,使其在BCP表面涂布均匀。待复合凝胶由流体状变为灰白色半钢性状态时植入缺 损部位。同法制备并植入BCP/HAFG人工骨。(3) BCP/rhBMP-2工骨的制备:利用部分真空吸入法[1]将 rhBMP -2和BCP结合在一起。制成的每支人工骨中约含rhBMP-2 1mg,植入前人工骨在密封包装下环氧 乙烷气体消毒24 h。 1.2 实验动物及分组 新西兰兔60只,体重2.5~3.2 kg,雌雄不限。随机分为3组:A组为BCP/HAFG-rhBMP-2组;B组为 BPC/rhBMP-2组;C组为BPC/HAFG组。 1.3 实验方法 用质量分数为3%的戊巴比妥钠(1ml·kg-1 )静脉麻醉后,每兔随机选用左右侧前肢,经剃毛、消毒,取桡侧切口切开皮肤及皮下组织,显露桡骨干中段,用单片小锯锯下10 mm连带骨膜骨段,然后按组分别植入相应人工骨材料。术后给予庆大霉素10 000 U·kg-1,每日2次肌肉注射,连续注射3d。常规条件下喂养 观察。 1.4 大体观察 观察动物的饮食、活动、伤口反应,术后第2、4、8、12周分批处死动物并取材,观察植入材料的表面、局部成骨及炎症反应等情况。 1.5 X线观察 术后第4、8、12周摄片,由3人盲法按照Lane-sandhu X射线评分标准[2]进行评分。 1.6 碱性磷酸酶(AKP)活性检测 术后第2、4、8、12周3组各取5只动物,全麻后,从心脏抽血3 ml离心,使用AKP试剂盒行血清AKP活性测定。 1.7 桡骨生物力学检测 术后12周时,每组各取5个标本及正常桡骨标本 作力学强度测试。以材料植入处为中心截取桡骨长约1.4 cm。经牙托粉两端包埋后,置于MTS-858mini bionixII 型生物力学测试机上进行垂直压缩试验。加载速度为1 mm·min-1 ,最大位移设定3 mm。每隔0.1 s记录一次数据。 1.8 组织病理学观察 将每次所获取的桡骨标本作好标记置于10%甲醛中固定24 h后,经EDTA脱钙、梯度酒精脱水、石蜡包埋,沿桡骨纵轴连续切片,厚度为6 μm,HE染色,光学显微镜下观察。 1.9 扫描电镜观察 于术后第2、4、8、12周每组各取3个标本,2.5%戊二醛(pH 7.2~7.4)固定2 h,然后用PBS缓冲液冲洗2次,1%锇酸PBS液固定2h,再用PBS缓冲液冲洗2次,乙腈逐级脱水,真空干燥,表面离子溅射喷金处理,HITACHIS-520扫描电镜下观察标本的超微结构。 2.0 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件包,每组测得的X线评 分、AKP水平及生物力学评分采用方差及SNK分析,统计学显著水平为 α =0.05。 2 结 果 2.1 大体观察 术后动物前肢不能负重,跛行,术后1周恢复正常活动。所有动物切口均Ⅰ期愈合。术后2周时,A、B 组材料植入区有明显骨痂生成,而C组材料外周为纤维结缔组织包裹。术后8周,A组材料已部分降解,新生骨组织的形成量明显高于B、C组。12周A组骨缺损完全修复,而其他组骨缺损处仍可见到未吸收的材料及骨缺损(图1)。 BCP/ HAFG-rhBMP-2组骨缺损完全修复,骨皮质塑形良好(左);BPC/HAFG组材料未完全降解,缺损部分修复(中);BCP/ rhBMP-2组骨缺损大部分 愈合,仍可见少量未降解材料(右) 2.2 组织学观察结果 术后2周时,A、B组材料外周新骨开始形成,材料与新骨直接结合,材料内部孔隙中有纤维结缔组织 间充质细胞进入(图2)。C组材料外周为纤维结缔组织包裹,偶见炎性细胞浸润,材料内部可见纤维结缔组织填充。术后4周,各组骨缺损植入体孔隙中均有软骨细胞生成,其中A组软骨细胞量明显高于B、C组,材料均未见明显降解。术后8周,A组材料已部分降解,材料内、外新骨继续增多。B、C组植入的材料少量降解,成骨较稀少,主要位于材料的边缘区域。12周时,A组材料已基本降解,新生骨组织的形成量明显高于B、C组。孔隙中有大量成熟的条索状板层骨形成, 骨细胞排列规则,骨小梁较粗大,分布均匀,其间有骨髓组织,中心区板层骨较多,软骨较少(图3)。B、C组植入物孔隙中也出现板层骨,但以周边为主,其间偶见少量骨髓组织,中心区板层骨及软骨均较少。 2.3 AKP活性的变化 术后不同时间点3组AKP测定结果,见表1。在第2周,B组较A组和C组均明显增高( P <0.05);随着术后时间的延长,各组AKP活性逐渐降低,其中B 组降低较快,8周时A组AKP活性较其他两组高,差 异有显著性( P <0.05);A组与C组的AKP降低幅度 较平缓。在第2~12周时间段内,第12周与第2周相比较,A组降低了65.13%,B组降低了71.03%,C组 降低了58.59%。12周时各组AKP活性均恢复至正常水平。表1 3组术后各时间点AKP活性的变化(略) BPC/HAFG- rhBMP-2材料与新骨之间及材料内部孔隙中有纤维结缔组织和间充质细胞进入新生骨组织的骨小梁规则,骨髓腔及骨髓已形成,软骨细胞较。 2.4 生物力学测试结果 术后12周时A、B、C组植入材料和正常桡骨组的极限抗压强度分别为(538±12.7)N、(368±24.0)N、(256±8.4)N和(547±14.8)N。A组的极限抗压强 度与正常桡骨非常接近,无显著性差异( P >0.05),且两者的抗压强度均明显高于B组和C组,统计学分析差异有显著性( P <0.05)。 2.5 扫描电镜检查 术后2周A、B组可见排列致密的胶原纤维及大量钙盐结晶及小梁状新骨形成,C组未见明显钙结晶沉淀。4周时A组材料与骨界面形成骨组织与宿主骨结合,但新骨结构疏松,随时间延长,骨组织逐渐转向致密。到12周时A组材料已基本被成熟骨组织所代替,新骨结构与宿主骨无明显差别(图4)。而C和B组骨小梁结构疏松细小(图5),材料仍未完全被降解,材料与骨组织间形成较大间隙(图6)。 2.6 X线检查 (1)B组:4周时材料与骨界面形成骨组织与宿主骨小梁粗大,密集,较少见到骨吸收陷窝材料仍未完全被降解,可见羟基磷灰石 结晶,材料与骨组织间形成较大间隙骨紧密结合,骨缺损内见密度较高的BCP影,周围有 中等量骨痂形成;8周时BCP影密度降低,周围骨痂形 成较前有所增多;12周时BCP影部分消失,骨缺损大 部分愈合,骨髓腔部分再通(图7)。 (2)A组:4周时移 植材料与两骨端融合,骨缺损区有较多骨痂形成;8周时部分骨缺损已愈合,骨髓腔部分再通;12周时全部 骨缺损已愈合,皮质骨塑形良好,骨髓腔完全再通(图 8)。 (3)C组:4周时BCP影清晰;8周时BCP影密度降低,有少量骨痂形成;12周时大部分骨缺损仍存在 (图9)。Lane-sandhu X射线评分结果见表2。 表2 3组术后各时间点X射线评分结果(略) 3 讨 论 3.1 骨缺损的形成及治疗 由于某种因素如外伤、感染、肿瘤等而使骨丧失了一些骨质,形成较大的间隙,称为骨缺损。骨缺损修复最常用的方法是自体骨或异体骨移植,但自体骨移植的不足是取骨数量受限、影响供骨区生物力学强度和功能、增加患者创伤和痛苦;异体骨具有自体骨一些优越的组织特点及可减少手术次数,但其存在免疫排斥 反应,并有感染HIV和肝炎病毒等可能,而且制样、处理和存贮的成本很高。为克服自体骨和异体骨移植的 缺点,人们开始探索利用生物材料修复骨缺损。目前,用于骨缺损修复的生物材料主要有两大类,一类为人工合成生物材料,如聚乳酸(PLA)、钙磷陶 瓷、聚乙醇烯(PVA)等;另一类为天然高分子材料,如胶原、骨生长因子(BMP)、明胶等。其中聚乳酸类因缺 乏骨传导性、机械强度差及降解产物酸性大等缺点,使其在应用上受到了限制。与其相比生物活性陶瓷具有 较好的生物相容性和骨传导性能。因而近年来国内外对生物活性陶瓷骨替代材料的研究日趋增多。目前对 该类材料的研究主要着眼于利用先进的加工技术将其 与各种活性因子进行复合,以获得更好的骨缺损修复能力。 3.2 BCP/HAFG-rhBMP-2复合人工骨生物学特性及成骨作用 多孔双相钙磷陶瓷材料以钙、磷为主要成分,与骨基质中的无机成分相似。大量实验证明它具有良好的 生物相容性和降解性,但缺乏骨诱导活性[3]。试验中将双相钙磷陶瓷多孔支架与HAFG-rhBMP-2缓释体 系进行了复合,从而使该材料在具有良好的生物相容性及骨传导作用的基础上,又获得了较持久的体内诱 导成骨能力。骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein, BMP)是一种广泛分布于各种动物骨组织中的酸性多肽,具有骨诱导活性。但单纯的BMP在体内易被蛋白酶分解,其生物学活性难以得到持续性发挥[4]。为了克服这一问题,目前的研究主要是利用有机高分子化合物制成BMP缓释微球以获得体内缓释的效果,但在微球的制备工艺中常需要有机溶剂等理化因素的处理,这使BMP的生物活性受到了影响。本实验中选择HAFG复合凝胶作为rhBMP-2的缓释载体,利用纤维蛋白原发生快速γ交联和缓慢的α交联后形成半刚性三维网状纤维蛋白凝块,能将HA/rhBMP-2固定于纤 维蛋白凝块网孔内的特性,大大降低了HA在植入局部的溶散率,同时还避免了组织液及纤维蛋白酶过快地进入纤维蛋白凝块内部,从而使HAFG-rhBMP-2 复合凝胶缓释体系能在机体内存留较长的时间[5]。 BPC/HAFG-BMP-2复合型人工骨的作用机制及优点如下。(1)生物相容性:本试验将BCP与HAFG进行复合,使材料在成分及结构上与天然骨更为接近,再加上透明质酸及纤维蛋白凝胶聚合时释放各种生物活性因子,使得细胞更易于在材料表面黏附、增殖并分泌基质。因此该复合材料具有比单纯BCP更为良好的生物相容性。(2)骨诱导性:实验中将rhBMP-2与 HAFG制成缓释体系后再和BCP进行了复合。由于HA带大量的负电荷,能与带正电的rhBMP-2形成较好结合,再加上三维网状纤维蛋白凝块具有较强的吸附及降低HA/BMP溶散的作用,使得rhBMP-2可随着复合凝胶的降解缓慢释放,能较长时间保持局部有效浓度。试验中对AKP检测及组织学的观察结果均提示BPC/HAFG-rh BMP-2复合型人工骨的诱导成骨活性较BPC/rhBMP-2人工骨更为持久。(2)生物降解性:由于羟基磷灰石和磷酸三钙(tricalcium phos-phate,TCP)在体内降解速度过快,与新骨生长速度不匹配,同时也影响材料植入后的稳固性能[6]。试验中利用羟基磷灰石的高强度、高生物活性及稳定性,将其 与TCP合成BCP系统,使得材料在体内的降解与新骨的生长更为匹配。(3)骨传导性:BCP主要是依靠它的三维多孔结构,尤其是它的合适孔径和孔隙间的连通,为成骨细胞的长入提供支撑作用[7]。 因此,BPC/HAFG-rhBMP-2人工骨是一种较理想的骨移植替代材料,具有较高的临床实用价值。但多孔BCP本身在力学强度及脆性方面还有一定的缺陷,所以将其作为负重骨缺损的修复材料还需要作进一步探讨。 [致谢]本研究中的BCP材料由东南大学材料科 学与工程学院生物材料研究组董寅生老师提供。 【参考文献】 [1] Urist M R,Lietze A,Dawson E.Beta-tricalcium phosphate delivery system for bone morphogenetic protein[J].Clin Or-thop Relat Res,1984,(187):277 -280. 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