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悬饮宁方对SPC           ★★★ 【字体：小 大】
悬饮宁方对SPC
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-1    
作者：徐振晔，刘建文，周美云
【关键词】  悬饮宁方
    ［摘要］  目的：观察中药悬饮宁方抑制人肺腺癌细胞SPCA1浸润的作用及对S180腹水瘤小鼠腹膜病理形态学变化的影响。方法：在进行小鼠腹膜间皮细胞分离培养的基础上，将SPCA1人肺腺癌细胞调整加入复层培养，观察形成的克隆数。取出S180腹水瘤小鼠腹膜，用透射电镜观察悬饮宁方各剂量组小鼠腹膜病理形态学的变化。结果：体外实验显示加入含有悬饮宁生药的培养液(50 μg/ml)后，SPCA1在琼脂培养皿背面形成的癌细胞克隆数明显减少。用悬饮宁治疗S180腹水瘤小鼠后，取出腹膜，在电镜下可观察到，从低剂量开始即可见小鼠腹膜间皮细胞排列整齐，随着剂量的递增这种现象更明显，间皮细胞排列更加整齐，增厚；而生理盐水组小鼠腹膜间皮细胞排列疏松，坏死。结论：中药悬饮宁方有抑制SPCA1细胞浸润的作用，悬饮宁还可以改变S180腹水瘤小鼠排列疏松的腹膜间皮细胞，从而控制腹水瘤小鼠癌性积液生长。
　　［关键词］  悬饮宁方; SPCA1细胞; 间皮细胞; S180腹水瘤; 小鼠
　　Effects of Xuanyinning Recipe on invasion of SPCA1 cells and pathomorphological changes of peritoneum in mice inoculated with sarcoma 180
　　ABSTRACT  Objective: To observe the effects of Xuanyinning Recipe (XYNR) in inhibiting SPCA1 cellular infiltration and on the pathomorphological changes of peritoneum in mice inoculated with sarcoma 180 (S180). Methods: On the bases of isolated culture of mouse peritoneal mesothelial cells, we adjusted and added the human lung adenocarcinoma cell line SPCA1 into the doublelayer culture medium to observe the number of clones formed. We also took out the peritoneum from the mice administered with three different dosages of XYNR and observed its pathomorphological changes with transmission electron microscope. Results: In the in vitro experiment, the number of clones of SPCA1 in culture medium with XYNR (50 μg/ml) decreased distinctly. In the in vivo experiment, it was observed that, in the peritoneum from the XYNRtreated mice inoculated with S180, the mesothelial cells arranged more and more regularly with the increasing of the dosage of XYNR, while the mesothelial cells in the peritoneum of the mice in the control group necrosed and arranged loosely. Conclusion: XYNR can inhibit the invasion of SPCA1 cells. It also can improve the loose arrangement of the peritoneal mesothelial cells in mice inoculated with S180, so as to inhibit the malignant effusion.
　　KEY WORDS  Xuanyinning Recipe; SPCA1 cells; mesothelial cells; sarcoma 180; mice
　　研究资料表明，大约50%的癌症转移患者最终发生癌性积液［1］。而癌性积液的出现常常预示着疾病的进展和生活质量的下降，表明疾病进入晚期，生存时间4～6个月［2］。我们在临床及实验中观察到中药悬饮宁方能有效地控制癌性积液生长［3］，为了进一步探讨悬饮宁方抑制癌性积液生长的作用机制，我们进行了悬饮宁方对SPCA1细胞浸润作用的体外实验，并通过电镜观察该方对S180腹水瘤小鼠腹膜组织病理形态的影响，现报告如下。
　　1  材料与方法
　　1.1  主要仪器与试剂  超净工作台，上海大华医疗仪器厂生产；CO2培养箱，日本平尺株式会社生产；倒置相差显微镜，日本Olympus公司制造；达氏修正依氏培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM）培养粉，由日本制药株式会社生产；表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)，由上海细胞生物学研究所提供；胰酶、酚红、琼脂粉、35 mm培养皿均由中国科学院实生细胞生物技术公司提供；顺氯氨铂，由中国齐鲁制药厂生产(批号：9386162)，规格20 mg／瓶；S180腹水瘤细胞株，引自中国科学院上海分院药物研究所。
　　1.2  实验动物  昆明种小鼠，雌雄各半，体质量（20±2）g，6～8周龄，由中国科学院上海分院实验动物中心提供（动物合格证号：中科动管005）。
　　1.3  实验药物制备
　　1.3.1  体外实验用药  悬饮宁液药物按协定比例配方（由生白术、川椒目、葶苈子、猫人参等中药组成），用三蒸水煎取，用乙醇明胶沉淀法制成，生药终浓度为1 g／m1，pH值为6.8～7.2。
　　1.3.2  体内实验用药  悬饮宁药液由上海中医药大学龙华医院中药药房提供，每毫升含生药浓度为2.8 g。用生理盐水稀释成2.49、1.2、0.6 g／ml。按《中药药理实验方法学》附表“人和动物间接体表面积折算表［4］”，计算出高、中、低不同剂量组的用药剂量分别为52.36、32.36、20 g／kg；每只小鼠每日用药量分别为1.047、0.647、0.4 g，灌胃用药。顺氯氨铂，用生理盐水稀释成0.2 mg／m1，1 mg／kg，每日腹腔注射1次。
　　1.4  实验方法
　　1.4.1  抑制SPCA1细胞浸润作用的体外研究
　　1.4.1.1  腹膜间皮细胞的分离培养  把正常小鼠脱颈处死后，剖腹在无菌条件下由小肠间膜内的脂肪组织取出回盲肠部向口侧方向的三角形半透明膜，尽量剔除脂肪，置入PBS冲洗后，加入0.25％胰蛋白酶，置37 ℃消化10～20 min，吸出消化液，离心收集细胞，用 DMEM培养液（配制方法：DMEM培养粉,加入L右氨酰氨0.3 g/L、小牛血清、青霉素200 U/ml、链霉素200 U/m1、EGF 25 ng／m1，pH 6.8~7.2），在培养瓶中置37 ℃、5％CO2培养箱中培养。
　　1.4.1.2  间皮细胞层上的癌细胞复层培养  上述鼠腹膜间皮细胞经传至3～5代后，即可转入铺有琼脂的35 mm的培养皿培养，每只培养皿细胞数为105，隔2 d更换新鲜培养液，经5～7 d培养后，间皮细胞贴壁生长成片状。待间皮细胞生长成片状后，将SPCA1人肺腺癌细胞株(每只培养皿细胞数为2×105)调整加入每只培养皿后，在倒置显微镜下取一视野进行观察，约经5 h左右，可观察到癌细胞伸出伪足，开始侵入，7 h后癌细胞穿越间皮细胞间隙，次日(24 h后)可在培养皿的背面，间皮细胞下层分裂，逐浙形成克隆。
　　1.4.1.3  悬饮宁方对癌细胞浸润腹膜间皮细胞的影响  将悬饮宁液用DMEM培养液稀释成6.25、25、50 μg/m1三种不同浓度，pH (7.0±2)。分为空白对照组、中药Ⅰ组(6.25 μg/m1)、中药Ⅱ组(25 μg/m1)、中药Ⅲ组(50 μg/m1)，共4组，每组n=3。在培养皿中置入SPCA1人肺腺癌细胞后，移入含不同浓度生药的培养液，经培养72 h后观察培养皿背面形成的克隆数，换算成克隆数／cm2，作统计学处理，比较组间差异。
　　1.4.2  S180腹水瘤小鼠病理形态学观察
　　1.4.2.1  瘤株及移植方法  S180腹水瘤细胞株于昆明种小鼠腹腔移植传代。取移植14 d左右的小鼠，无菌操作，从腹腔抽出腹水瘤细胞液，经生理盐水稀释，调整细胞浓度为2×l06，于每只正常小鼠腹腔注射0.5 m1，约含S180细胞1×106，接种完毕后于次日开始用药。
　　1.4.2.2  实验动物分组  经造模后随机分为5组，每组12只。生理盐水组：每日以生理盐水1 m1灌胃；顺氯氨铂化疗组每日腹腔注射顺氯氨铂0.02 mg (1 mg/kg)，共5 d；悬饮宁治疗Ⅰ组每日0.4 g(20 g/kg)生药灌胃，悬饮宁治疗Ⅱ组每日0.647 g(32.36 g／kg)生药灌胃，悬饮宁治疗Ⅲ组每日1.047 g(52.36 g／kg)生药灌胃。第―批每组用药共18 d，第二批观察14 d，每组各8只实验小鼠。
　　1.4.2.3  腹膜组织的病理形态学观察  脱颈处死小鼠，取出腹膜，用2.5％戊二醛固定，然后用2％锇酸再固定，梯度酒精脱水，EPON812环氧树脂包埋，超薄切片，经醋酸钠及柠檬酸铅染色，JEMl00B透射电镜观察。
　　1.5  统计学方法  计量资料用t检验。
　2  结果
　　2.1  悬饮宁方对培养的SPCA1细胞浸润腹膜间皮细胞的抑制作用  从小鼠小肠间膜内分离的间皮细胞，在含有EGF的DMEM培养液中生长3～4 d，即可长成细胞单层，其形态见图1。
　　图1  小鼠腹膜间皮细胞单层培养(×100)（略）
　　Fig 1  Mouse peritoneal mesothelial cells cultured on a single layer (×100)
　　在胶原培养皿中植入SPCA1人肺腺癌细胞，在空白对照组，经72 h培养后，可见到SPCA1人肺腺癌细胞穿越腹膜间皮细胞，在琼脂培养皿背面形成癌细胞克隆，见图2。
　　图2  SPCA1细胞克隆（空白对照组）(×100)（略）
　　Fig 2  SPCA1 cell clones in control culture medium (×100)
   
　　当换入含悬饮宁生药的培养液后，琼脂培养皿背面形成的癌细胞克隆数减少。以加入含有50 μg/ml悬饮宁生药的培养液后人肺腺癌细胞在琼脂培养皿背面形成的癌细胞克隆数减少最为明显，见图3。
　　图3  加入含 50 μg/ml悬饮宁的培养液时形成的SPCA1细胞克隆 (×100)（略）
　　Fig 3  SPCA1 cell clones in culture medium with 50 μg/ml XYNR (×100)
　　2.2  悬饮宁方抗S180腹水瘤细胞浸润小鼠腹膜的电镜观察
　　2.2.1  正常小鼠腹膜的电镜观察  正常小鼠腹膜间皮细胞排列紧密，紧靠结缔组织，细胞内见线粒体、内质网等结构。见图4A。
　　2.2.2  生理盐水组S180腹水瘤小鼠腹膜电镜观察  生理盐水组S180腹水瘤小鼠腹膜间皮细胞排列疏松，坏死细胞与结缔组织之间见纤维。巨噬细胞内见当量溶酶体（为吞噬间皮细胞坏死部分）。见图4B。
　　2.2.3  悬饮宁高剂量组S180腹水瘤小鼠腹膜电镜观察  悬饮宁高剂量组S180腹水瘤小鼠腹膜间皮细胞排列整齐，细胞增厚，细胞内可见吞噬体。见图4C。
　　图4  小鼠腹膜电镜观察（略）
　　Fig 4  Micrograph of peritoneum observed from transmission electron microscopy
　　A: Normal control mouse (HE staining, ×6 000); B: NS-treated mouse inoculated with S180 (HE staining, ×10 000); C: High dosage XYNR-treated mouse inoculated with S180 (HE staining, ×10 000)
　　3  讨论
　　目前对于癌性积液手术、放疗和化疗疗效不佳，且预后恶劣。治疗上大多主张腔内注入抗生素、化疗药物、生物反应调节剂等，疗效仍不满意，且副反应较多。癌细胞的增殖浸润直接影响着患者的预后。因此，积极寻找有效的治疗方法与药物，控制其增殖浸润转移，是目前肿瘤学界研究的一个重点。悬饮宁方由生白术、川椒目、葶苈子、猫人参等中药组成，主要有泻肺利水、健脾利水、行气利水等功效，扶正不碍邪，祛邪而不伤正。这与一般峻泻逐水方药有明显的区别，正符合晚期恶性肿瘤的治疗法则。长期的临床观察证实，悬饮宁方对控制癌性积液胸水具有良好的作用［3］。
　　以前对浸润过程的病理形态学观察，仅限于定性的观察，在定量评价癌细胞浸润能力上较为困难。随着细胞生物学技术的发展，近年来人们运用的体细胞复合培养方法，在定量观察癌细胞浸润能力上有较高的利用价值。这种方法不仅能观察癌细胞浸润到间质细胞的情况，还能观察各种浸润增强因子和抑制因子的作用。本方法在35 mm的培养皿上铺入一层基质，有模拟体内细胞基质的作用，从而能在体外再现癌细胞浸润的体内过程。
　　各种不同的癌细胞株浸润能力存在差别，这与癌细胞内的癌基因表达有关。此外，癌细胞的浸润能力与宿主细胞有十分密切的关系。本实验结果显示，SPCA1人肺腺癌细胞对腹膜间皮细胞有明显浸润作用，其穿过间皮细胞层后，可在琼脂基质下形成克隆，当加入含生药的培养液后，癌细胞对间皮细胞的浸润能力受到明显抑制，在基质下形成的克隆数明显减少。这提示悬饮宁液在体外有抑制癌细胞对腹膜间皮细胞浸润的作用，这种抑制作用与在体内抑制癌性腹水形成相关［3］，从而表明悬饮宁液抑制腹水形成的机制与抑制癌细胞对宿主细胞的浸润能力相关。这种抑制浸润作用与药物浓度呈正相关，在50 μg/ml时克隆明显减少。
　　我们用悬饮宁治疗S180腹水瘤小鼠后，取出腹膜，在电镜下可观察到从低剂量开始即可见到间皮细胞排列整齐，紧靠结缔组织，见纤维母细胞。随着剂量的递增这种现象更明显，间皮细胞排列更加整齐，增厚。而生理盐水组间皮细胞排列疏松、坏死。由此可见，悬饮宁还通过改变荷瘤小鼠排列疏松的间皮细胞达到控制腹水瘤小鼠癌性积液生长之目的。
　　［参考文献］
　　1Rusch VW, Harper OR. Pleural effusions in patients with malignancy［A］. In: Roth JA, Ruckdeschel JC, Weisenburger TH (Eds.). Thoracic Oncology［M］. Philadelphia: WB Saunders Company,1989.594.
　　2  Belani CP, Pajeau TS, Bennett CL. Treating malignant pleural effusions cost consciously［J］. Chest, 1998,113(1 Suppl): 78S85S.
　　3  徐振晔, 朱晏伟, 周卫东, 等. 悬饮宁治疗癌性积液的临床与实验研究［J］.上海中医药杂志, 2001, 35(8): 1113.
　　4  李仪奎, 王钦茂.中药药理实验方法学［M］.第6版.上海：上海科学技术出版社, 1991. 56120
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