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慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰IL8、TNFα水平和炎症细胞的分布           ★★★ 【字体：小 大】
慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰IL8、TNFα水平和炎症细胞的分布
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-1    
【摘要】  目的 比较稳定期慢性阻塞性肺疾病(COPD)老年患者、老年健康吸烟者和老年健康非吸烟者痰液中IL8、TNFα水平和炎症细胞组成的差异，进而探讨IL8、TNFα、中性粒细胞与吸烟的相关性以及COPD气道炎症的性质。 方法 98例老年研究对象分为3组：COPD组38例、健康吸烟组（HS）30例、健康不吸烟组（HNS）30例，诱导痰方法收集痰液，细胞分类及计数，并用酶联免疫吸附法(ELISA)测定痰上清液中IL8、TNFα浓度。结果 COPD组痰液中IL8,、TNFα、中性粒细胞百分比明显高于健康吸烟组及健康不吸烟组；COPD组痰液中IL8、TNFα水平与中性粒细胞百分比呈显著正相关性（r=0761,r=0495）；健康吸烟组痰中IL8水平与中性粒细胞百分比亦呈显著正相关性（r=0544）。结论 IL8和TNFα和中性粒细胞共同参与了吸烟者COPD气道炎症反应。
【关键词】  慢性阻塞性肺疾病；气道炎症；IL8；TNFα；中性粒细胞
　　约80%～90%的慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者是吸烟者，但是仅有20%的吸烟者发展为COPD〔1〕，提示对COPD易感性不同的人群，其气道对同样的香烟刺激的反应性不同。目前认为，吸烟引起的气道和肺组织异常的炎症反应是COPD发病学的中心环节，多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子参与COPD复杂的炎症网络。以往的研究认为在COPD急性加重期气道中性粒细胞明显增加〔2〕，而在稳定期COPD患者和吸烟肺功能正常者之间气道中性粒细胞是否存在差异争议颇大〔3～5〕。IL8和TNFα有较强的中性粒细胞趋化作用，本文比较了稳定期COPD老年患者、老年健康吸烟者和老年健康非吸烟者痰液中IL8、TNFα水平炎症细胞的差异，进而探讨COPD气道炎症的性质。
　　1 材料与方法
　　11 研究对象          
　　本研究对象均为男性，来自2004～2005年门诊病例及健康查体人员，经询问病史、体检、X线检查、肺通气功能检查，分为以下3组：
　　111 COPD组          
　　符合中华医学会呼吸病学分会COPD诊断标准〔6〕并处于稳定期的患者38例，年龄60～78岁，平均（636±62）岁，均有吸烟史，其中戒烟者4例，戒烟年限15～23年，吸烟年限18～46年，根据肺功能测定结果，对COPD的严重程度进行分级〔6〕。本组病人支气管舒张试验均为阴性，排除呼吸道变态反应病史及肺癌、心功能不全等疾患。
　　112  健康吸烟组（HS）          
　　30例，年龄61～73岁，平均（641±59）岁。肺功能检测FEV10占预计值(pred)百分比均＞80% ，FEV10/FVC均＞70%，支气管舒张试验均为阴性。排除呼吸道变态反应病史及肺癌、心功能不全等疾患。
　　113  健康不吸烟组(HNS)：30例，年龄60～74岁，平均（635±71）岁。肺功能检测FEV10占预计值百分比均＞85%，FEV10/FVC均＞70%。
　　12  实验步骤及方法
　　121 肺功能检查          
 
　　所有研究对象在入选前进行肺功能测定，记录用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气量(FEV1)、第1秒用力呼气量占预计值百分比(FEV1/pred%)、第一秒用力呼气量占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC%)。
　　122  痰标本的收集及处理           
　　参照文献〔7，8〕报道的方法，首先吸入喘康速200 μg，超声雾化吸入3%高渗盐水（雾化量为04 ml/min），雾化时间为5～10 min。将病人咳出的痰收集于无菌干燥的培养皿中，挑选出黏液部分放入无菌干燥试管中称重，加入4倍量01%DTT（二硫苏糖醇），37℃水浴15 min，以有效溶解痰液，再加入4倍量磷酸盐缓冲液（001 mol/L pH74 PBS）充分洗涤细胞5 min，2 000 r/min离心10 min。离心后的上清液-70℃保存待测，沉淀留作痰细胞学检查。
　　123  痰液细胞计数及分类          
　　制备痰细胞学涂片2～3张，室温下自然风干，做HE染色。光学显微镜下进行细胞计数及分类，至少计数300个细胞，分类计数中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞及嗜酸性粒细胞，检查两张涂片，取其平均数，得出各种细胞所占百分率。
　　124 痰上清液IL8、TNFα浓度的检测          
　　IL8、TNFα采用酶联免疫吸附法（ELISA）。操作步骤按试剂盒(美国GeneMay公司)说明书进行，敏感度为16 pg/ml。
　　13 统计学分析          
　　数据均以x±s表示，组间比较分析用t检验或t′检验、χ2检验。数值变量之间的依存关系用相关系数r表示，并应用t检验，使用统计学处理软件医用CS103、Microsoft excell处理原始数据，并图示其相关性。
2  结 果
　　21 COPD组与HS组病例资料比较          
　　见表1。表1 COPD组与HS组病人资料比较(略)
　　22 炎症细胞计数与分类          
　　痰液中的细胞主要是中性粒细胞和巨噬细胞，嗜酸性粒细胞、淋巴细胞。COPD组诱导痰中性粒细胞百分比明显高于HS组（t=834）及HNS组（t=1115 ），差异有显著性（P＜001）。HS组与HNS组痰中性粒细胞的百分比相比较，差异有显著性(t=348,P＜001)。各组间嗜酸性粒细胞和淋巴细胞分类差异无显著性（见表2）。表2 各组痰液细胞分类的比较(略)
　　23 各组间诱导痰上清液IL8水平比较          
　　COPD组明显高于HS组和HNS组，差异有显著性（t=397,t′=315,P＜001）；HS组明显高于HNS组，差异有显著性（t′=204,P＜005）(见表3)。在COPD组内，中、重度患者与轻度患者比较，差异无显著性〔(13641±3095) ng/L vs (12029±3269) ng/L〕。
                       
　　健康吸烟组内，吸烟指数＞400支/年的患者组与吸烟指数＜400支年组比较，差异无显著性〔(10571±2757) ng/L vs (8972±2674) ng/L，t=161,P＞005)〕。
24           
　　各组间诱导痰上清液TNFα水平的比较            COPD组与HS组和HNS组相比较，差异有显著性（t′=203,t′=232,P＜005）；HS组与HNS组相比较，差异无显著性意义(见表3)。
                       
　　COPD组内不同病情程度的患者，中、重度患者与轻度患者比较，无显著性差异〔(518±238) ng/L vs (445±209) ng/L〕。
　　25 各组诱导痰IL8、TNFα和中性粒细胞比率与肺功能之间的相关性分析          
　　COPD组诱导痰IL8水平与中性粒细胞比率之间呈显著正相关（r=076,t=591,P＜0001）。HS组痰IL8与中性粒细胞比率之间呈显著正相关关系（r=056,t=3649,P＜0002）。HNS组痰IL8与中性粒细胞比率之间无相关性关系（r=0336,t=189,P＞005）。COPD组痰中TNFα与中性粒细胞比率之间呈正相关关系（r=0430,t=2860 6,P＜001）。
　　COPD组痰中性粒细胞比率与FEV10/FVC%之间呈显著负相关性关系（r=-0594,t=4316,P＜0001）。COPD组IL8与FEV10/FVC%之间呈显著负相关性关系(r=-0588 4,t=437,P＜0001)。COPD组TNFα水平与FEV10/FVC%之间无显著相关性关系(r=0274 5,t=1712 8,P＞005)。表3 各组痰液IL8、TNFα水平的比较(略)
　　3 讨 论
                       
　　根据文献报道，在吸烟者的中央气道壁，T淋巴细胞和巨噬细胞是主要的炎症浸润细胞〔9，10〕，中性粒细胞较少出现在气道壁，而主要是在气道腔内（痰液或支气管肺泡盥洗液）数量增加〔11〕。中性粒细胞在管壁和管腔内的分布呈现分离现象。这种分离现象提示，气道腔内的炎症可能与吸烟导致的支气管壁的慢性炎症机制不同，中性粒细胞可能在某种刺激因子作用下迅速跨上皮移动到气道腔内。在此过程中，前炎症细胞因子和抗炎症反应细胞因子失衡可能发挥一定的作用。 IL8和TNFα是巨噬细胞在香烟烟雾刺激下释放的重要的前炎症因子。IL8是中性粒细胞和T淋巴细胞强效趋化因子及化学激活剂〔12〕，可引起中性粒细胞在向呼吸道迁移、活化。TNFα通过诱导上皮细胞ICAM1表达上调，中性粒细胞表面C3bi受体/黏着糖蛋白表达增加，使内皮与中性粒细胞的黏附力显著增强〔13〕，在趋化因子的作用下逐步向气道移行。TNFα还可诱导支气管上皮细胞表达并分泌IL8〔14〕，同时促进激活的中性粒细胞分泌IL8、TNFα。本研究结果显示，COPD组痰IL8水平明显高于HS及HNS组，且IL8浓度与中性粒细胞的百分比存在明显的正相关关系，IL8与FEV10/FVC%之间呈显著负相关性关系；COPD组 痰TNFα水平明显高于健康吸烟组及健康不吸烟组，且与中性粒细胞的百分比存在明显的正相关关系，表明IL8和TNFα在COPD发生发展中起重要作用。
                      
　　活化的中性粒细胞，可释放多种蛋白酶如中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)参与肺组织的降解，并促进腺体分泌。NE可促进IL8 RNA高表达〔15〕，进一步加重气道炎症。另一方面，吸烟、感染或吸入有害物质，可启动中性粒细胞呼吸爆发，产生多种氧化物，直接损伤细胞膜和细DNA,同时可活化核因子如NFκB，诱导产生更多的炎性调节因子如IL8、TNFα、IL1β、GMCSF、ICAM1、VCAM1等，进一步放大炎症。本试验结果显示，痰中性粒细胞的百分比明显高于健康吸烟组及健康不吸烟组，说明中性粒细胞在气道腔内聚集、活化是COPD重要的气道炎症标志。
                       
　　本研究发现，健康吸烟者痰IL8水平明显高于健康不吸烟者，且IL8浓度与中性粒细胞的百分比存在明显的正相关关系，表明即使是肺功能正常的吸烟者气道内也已有气道炎症的存在。 本实验结果还显示，健康吸烟组吸烟指数＞400支年的患者与吸烟指数≤400支年的患者的IL8相比较，差异虽然无显著性，但随着吸烟指数的增大IL8的水平有增高趋势。
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