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SiRNA真核表达载体阻断HeLa细胞stathmin基因表达研究           ★★★ 【字体：小 大】
SiRNA真核表达载体阻断HeLa细胞stathmin基因表达研究
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-1    
作者：王燕，吴冰，苏海川，刘丽，林芳，张惠中
【关键词】  真核表达载体
    Blocking effect of vectorbased siRNA on stathmin gene expression in human HeLa cells
　　【Abstract】  AIM: To explore the blocking effect of siRNA on the expression of stathmin gene in HeLa cell line using siRNA eukaryotic expression vector. METHODS:  Two stathmin siRNA cDNAs were synthesized according to the stathmin gene sequence and cloned into the vector pSilencer4.1CMVneo and named pSilencerS1 and pSilencerS2 respectively, which were further identified by restriction endonuclease digestion analysis and DNA sequencing. HeLa cells were then transfected with pSilencerS1 and pSilencerS2. After G418 selection, the cells were selected and the interfering effect was detected by RTPCR. RESULTS:  Restriction endonuclease digestion analysis and DNA sequencing results showed that the 2 target segments were cloned into pSilencer4.1CMV neo vector respectively. The results of RTPCR indicated that both siRNA vectors could successfully knock down stathmin gene expression. CONCLUSION: The vectorbased siRNA on stathmin gene can effectively knock down stathmin gene expression, which has the potential of being applied  in gene therapy against malignant tumors.
　　【Keywords】  stathmin; RNA, small interfering; eukaryotic expression vector; HeLa cells
　　【摘要】 目的： 构建人stathmin基因的siRNA真核表达载体，探讨其对HeLa细胞中stathmin基因表达的干涉作用. 方法： 将合成的siRNA寡核苷酸链退火形成双链，连接入经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pSilencer4.1CMV neo真核表达载体，酶切及测序鉴定. 脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞，G418筛选后RTPCR检测其对stathmin基因mRNA的干涉效果. 结果： 经酶切及测序鉴定，成功构建siRNA真核表达载体. 经脂质体转染HeLa细胞后，RTPCR显示所构建的干涉stathmin基因的真核表达载体成功地抑制了目的基因的表达，HeLa细胞中stathmin基因的mRNA表达水平明显降低. 结论： 成功构建了人stathmin基因的RNA干涉真核表达载体pSilencerS1和pSilencerS2，并在HeLa细胞中有效地发挥了对stathmin基因表达的干涉作用.
 
　　【关键词】 stathmin； RNA，小分子干扰；真核表达载体；HeLa细胞
　　0引言
　　Stathmin为一种高度保守的细胞内蛋白，在多种恶性肿瘤细胞中高表达，研究表明［1，2］通过应用反义核酸、单克隆抗体、核酶、stathmin蛋白抑制剂及丝氨酸位点突变体等方法封闭该基因表达均证实，抑制其表达可使细胞受阻于G2/M期，同时还可以使恶性肿瘤表型发生逆转. 因此，stathmin是一个极具吸引力的恶性肿瘤生物治疗新靶点. RNA干涉是最新的基因敲除技术，具有高效性和特异性，能够降解与之序列相对应的细胞内mRNA, 使基因转录后沉默. 许多学者［3-5］认为该技术的出现是基因功能研究及基因治疗研究手段的又一次革命性突破. 本试验通过构建针对stathmin基因的siRNA真核表达载体，以阻断肿瘤细胞内stathmin基因的表达，探讨肿瘤基因治疗新的模式.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　质粒提取试剂盒（Wizard　plus　Minipreps　DNA　Purification　System）, pGEMTeasy 载体连接试剂盒，逆转录试剂盒Reverse Transcription System购自Promega公司. pSilencer4.1CMV neo载体及阴性对照pSilencer4.1CMV neo negtive control为 Ambion公司产品. 限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ为Takara公司产品，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司. TaqDNA聚合酶，DGL2000DNA Marker及琼脂糖凝胶购自鼎国生物技术有限公司. HeLa细胞及宿主菌株大肠杆菌JM109为本实验室保存.
　　1.2方法
 
　　1.2.1针对stathmin基因的siRNA cDNA设计和制备根据GenBank中stathmin基因的序列及siRNA设计原则，在编码区内选择两段19nt(分别位于基因序列中：398417;540559)作为不同的干涉区域，分别进行BLAST分析. 根据RNA干涉载体pSilencer4.1CMV neo的要求分别于上、下游引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点. 每段各设计一对55个碱基的序列，由博亚生物技术有限公司合成. 两对stathmin基因的siRNA cDNA序列如下： 5′GGATCCGAAACGAGAGCACGAGAAA TTCAAGAGA TTTCTCGT
GCTCTCGTTTCAGAAGCTT3′，互补链为： 5′AAGCTTCTGAAACGAGAGCACGAGAAA TCTCTTGAATTTCTCGT
GCTCTCGTTTCGGATCC3′；另一对为：5′GGATCCCGTTTGCGAGAGAAGGATA TTCAAGAGATATCCTTCTCT
CGCAAACGAGAAGCTT3′,互补链： 5′AAGCTTCTCGTTTGCGAGAGAAGGATATCTCTTGAATATCCTTCT
CTCGCAAACGGGATCC3′. 斜体部分为siRNA cDNA序列，中间为Loop.
　　1.2.2构建siRNA的pSilencer4.1CMV neo真核表达载体将合成的互补链分别退火，形成带有粘端的双链，用T4连接酶分别连接入线性化的pSilencer4.1CMV neo载体中BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间. 转化Jm109大肠杆菌，挑选阳性克隆，扩增并提取质粒，用BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定. 酶切鉴定正确的克隆送上海基康公司测序，分别命名为pSilencerS1和pSilencerS2.
　1.2.3脂质体介导的HeLa细胞的转染在6孔板内按照2.0×105细胞/孔接种细胞，第2日转染重组质粒及阴性对照质粒pSilencer4.1CMV neo negtive control（空载体），操作步骤按Lipofectamine2000说明书进行. 转染后48h换为含G418的选择培养基培养，10~12 d后获得3种质粒转染后的HeLa细胞稳定克隆.
 
　　1.2.4RTPCR法检测转染重组质粒HeLa细胞中stathmin基因表达分别收集3种转染后的HeLa细胞和未转染的HeLa细胞各1.0×106, Trizol RNA 分离试剂提取细胞总RNA. 取5 μg总RNA，加入1 μL oligo(dT), 按照逆转录试剂盒说明书操作，合成cDNA第1链. PCR引物自行设计(基因序列中177626，扩增产物为449 bp). 上游引物为： 5′TACCGAAGAAGACTATAGGT3′；下游引物为5′ATCAGTCGAAGTCAGAGCA3′. 取2 μL逆转录产物为模板，PCR反应参数为：94℃预变性3 min； 94℃变性30 s， 58℃退火30 s， 72℃延伸30 s， 30个循环；72℃延伸10 min. 并以βactin引物为内参照，上游引物为： 5′TCTGACACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG3′，下游引物为： 5′ CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG 3′，RTPCR扩增出一条838 bp的βactin cDNA片段. 各取10 μL PCR扩增产物，1.5 g/L琼脂糖凝胶电泳0.5 h，凝胶图像分析仪分析结果.
　　2结果
　　2.1针对stathmin基因siRNA真核表达载体的构建将构建好的pSilencer4.1CMV neoS1和pSilencer4.1CMV neoS2质粒用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，切出700 bp大小的片段（CMV启动子+siRNA），其结果符合所构建质粒的特征（Fig 1）. 将菌种送上海基康生物有限公司测序，结果完全正确. 证实干涉载体构建成功.
　　2.2RTPCR法检测转染重组质粒HeLa细胞中stathmin基因表达 RTPCR产物电泳显示，转染pSilencerS1和pSilencerS2后，HeLa细胞中stathmin基因的mRNA表达水平明显降低（Fig 2）.
　　3讨论
    
　　RNA干涉技术是指生物体内导入短的（21nt23nt）双链ＲＮＡ(dsRNA)后使体内同源基因特异性的沉默. 这一现象首先在植物体及果蝇中发现，2001年以来发现在哺乳动物细胞中也普遍存在该作用，至今已有较多用于封闭病毒基因、癌基因及细胞因子等基因表达的报道. 虽然对其参与的酶及分子作用机制仍在探讨之中，但目前可以肯定，siRNA可以通过相关酶的作用（如： 螺旋helicase, 核酸酶nuclease）特异地与靶RNA结合，其后在RNA酶的作用下直接导致靶RNA的降解，从而达到封闭或改变靶基因表达的作用.
　　近年来stathmin吸引了更多的关注，因其在多种恶性肿瘤中高表达，目前已经证实的有： 白血病、淋巴瘤、神经系统胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌及消化系统恶性肿瘤等. 体外实验证明： 抑制stathmin基因表达能消除白血病细胞表型的改变. 体内实验也发现： 抑制stathmin能防止白血病的发生［6］. Stathmin蛋白表达对于维持和转变白血病细胞表达至关重要. 但没有证据表明其与恶性转变过程直接相关，但有实验证明高表达的stathmin对于肿瘤高增值率至关重要［7］. 因此，阻断stathmin基因的表达对于抑制肿瘤生长可能有重要的作用.本试验所构建的针对stathmin基因的siRNA真核表达载体对HeLa细胞中stathmin mRNA的表达有明显的抑制，表明我们所构建的siRNA成功地发挥了干涉效应. 从而为进一步探讨stathmin基因表达与恶性肿瘤发生、发展关系奠定了基础，同时为开发以stathmin基因为靶点的肿瘤基因治疗方法奠定了实验基础.
　　【参考文献】
　　［1］  Mistry SJ, Benham CJ, Atweh GF. Development of ribozymes that target stathmin, a major regulator of the mitotic spindle ［J］. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2001;11(1):41-49.
　　［2］  Iancu C, Mistry SJ, Arkin S, et al. Effects of stathmin inhibition on the mitotic spindle ［J］. J Cell Sci, 2001;114(Pt 5):909-916.
　　［3］  Kitabwalla M, Ruprecht RM. RNA interferencea new weapon against HIV and beyond ［J］.   N Engl J Med, 2002; 347(17):1364-1367.
　［4］  Tuschl T, Borkhardt A. Small interfering RNAs: A revolutionary tool for the analysis of gene function and gene therapy ［J］. Mol Interv, 2002;2(3):158-167.
　　［5］  Tuynder M, Susini L, Prieur S, et al. Biological models and genes of tumor reversion: Cellular reprogramming through tpt1/TCTP and SIAH1 ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2002;99(23):14976-14981.
　　［6］  Jeha S, Luo XN, Beran M, et al. Antisense RNA inhibition of phosphoprotein p18 expression abrogates the transformed phenotype of leukemic cells ［J］. Cancer Res, 1996;56(6):1445-1450.
　　［7］  Mistry SJ, Atweh GF.　Stathmin expression in immortalized and oncogene transformed cells ［J］. Anticancer Res, 1999;19(1A):573-577
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