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| 135Hz极低频电磁场对Hep G | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-1  |
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【关键词】 细胞凋亡 Growth and apoptosis of Hep G2 cells affected by extremely lowfrequency electromagnetic field 【Abstract】AIM: To investigate the effects of exposure to extremely lowfrequency electromagnetic field (ELF) on the growth and apoptosis of Hep G2 cells. METHODS: Hep G2 cells were exposed to a 135Hz ELF for 6, 12, 24 h respectively and then the cellular viability, cell cycle and percentage of apoptotic cells in the treated Hep G2 cells were measured respectively by methe thiazolyl tetrazolium (MTT) reduction assay and flow cytometry. The ultrastructural changes were observed by scanning and transmission electron microscopy. RESULTS: The absorbent value（A） was greatly decreased in Hep G2 cells exposed to ELF, compared with that in the corresponding control groups (P<0.01). The cellular viability was remarkably decreased with the increasing of exposure time (P<0.01). The G1 stage of the Hep G2 cells exposed to ELF was delayed and the percentage of apoptotic cells was increased with the increasing of exposure time. As shown by scanning and transmission electron microscopy, the treated cells were characterized by several specific morphologies: apoptotic cells shrank, formed blebs, while the plasma membrane and cellular organelles remained intact. In the nucleus, the chromatin condensed at the nuclear membrane. The cells disintegrated into apoptotic bodies. CONCLUSION: Exposure to 135Hz ELF can inhibit the viability of Hep G2 cells and induce cell apoptosis. 【Keywords】 extremely lowfrequency electromagnetic fields; apoptosis; Hep G2 cells 【摘要】 目的： 观察135Hz极低频电磁场（ELF）照射对Hep G2细胞生长及凋亡的影响. 方法： 用MTT比色法、流式细胞仪，检测经135Hz ELF照射6, 12, 24 h后相应时间点细胞的活性、细胞周期、凋亡细胞的比例，并用扫描电镜以及透射电镜观察细胞超微结构变化. 结果： ELF磁场暴露后，与相应对照组相比其A值均下降（P<0.01），细胞活性随照射时间延长而下降（P<0.01）；使Hep G2细胞G1期阻滞，凋亡率随照射时间延长逐渐增高. 扫描电镜以及透射电镜观察到实验组细胞几种特殊的形态学特征： 凋亡细胞收缩，出泡，质膜及细胞器保持完整. 染色质浓缩于核膜，最后，细胞解离成凋亡小体. 结论： 135Hz的ELF照射抑制Hep G2细胞生长并促进其凋亡. 【关键词】 极低频电磁场；细胞凋亡；Hep G2细胞 0引言 手提电话、计算机等家用电器方便人们生活的同时所产生的极低频电磁场(ELF)越来越引起人们的广泛关注. 如何诱导肿瘤细胞发生凋亡，成为治疗肿瘤的主要研究思路之一［2］.Simko等［3］报道ELF持续照射可诱导肿瘤细胞凋亡. 研究表明细胞内游离Ca2+的浓度与细胞凋亡密切相关［4］，胞内高浓度的Ca2+可以激活内源性核酸内切酶从而导致细胞发生凋亡［5］. 我们采用流式细胞仪技术、MTT法、扫描电镜以及透射电子显微镜对细胞周期、细胞活性、凋亡率及细胞超微结构进行观测. 1材料和方法 1.1材料 人肝癌Hep G2细胞，由病理教研室隋延仿教授惠赠. 主要试剂： 10 mL/L四氧化锇（美国FISHER SCIENTIFIC.CO），丙酮（天津化学试剂有限公司），EPON812（天津化学试剂有限公司），乙腈（天津博迪化工有限公司），醋酸双氧铀（LKBProdukter AB, Bromma）. 主要仪器：流式细胞仪（美国Couter ELITE ESP型）， JEE4X真空蒸发仪（日本电子公司），JFC1100离子溅射仪（日本电子公司）， S520扫描电子显微镜（日本 Hitachi）， LKBNova超薄切片机（瑞典）， JEM2000EX透射电子显微镜（日本电子光学公司）. 1.2方法 1.2.1Hep G2细胞培养将Hep G2细胞按照2.5×108/L 密度接种于带孔的培养皿以及培养瓶中，以完全培养基(10 mL/L胎牛血清，青、链霉素1×105 U/L) 送入50 mL/L CO2的培养箱，37℃常规培养. 1.2.2实验分组将细胞随机分为6组，实验组为3组，分别是6, 12, 24 h照射组；对照组为3组，分别是6, 12, 24 h对照组，对照组置于37℃孵箱中. 1.2.3ELF照射将Hep G2细胞放入XFDS超低频信号发生器中的TEM小室（Transverse electromagnetic cell，横电磁波传输小室)中，小室内温度被控制在（35.2±0.2）℃，并保持恒温. 将频率调至135Hz，电场强度为80 V/m，分6, 12, 24 h, 37℃进行辐照. 1.2.4MTT法检测细胞活性将Hep G2细胞均匀接种于96孔板，每组10个样本，细胞密度为1×107/mL，分别照射6, 12, 24 h后实验组以及对应时间点对照组弃去培养液，96孔板每孔加入MTT（5 g/L）20 μL, 37℃继续培养4 h，吸弃上清液，每孔加入150 μL二甲亚砜（DMSO），振荡10 min，使结晶充分溶解，选取A490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测各孔A值. 1.2.5流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率① 分别将6, 12, 24 h照射组及对应时间点对照组的Hep G2细胞消化，吹打成单细胞悬液； ② 将单细胞悬液在室温条件下离心，1400 r/min离心5 min后弃上清；③ 用冷PBS液洗涤一次；④ 将细胞以1×109/L的浓度重新悬浮于700 mL/L的乙醇中室温下固定30 min， PI染色；待测细胞凋亡率的活细胞用膜联素V（Annexin V）试剂盒进行标记， Couter ELITE ESP型流式细胞仪（FCM）检测细胞周期分布及凋亡率. 1.2.6扫描电镜观察① 制备细胞爬片： 将细胞制成细胞悬液，接种于含12 mm×12 mm盖玻片的培养板中，密度为4×108/L，常规培养；待细胞长成单层后，135 Hz ELF照射24 h; 0.01 mol/L PBS洗，5 min×2次，30 mL/L戊二醛固定30 min, 0.01 mol/L PBS洗，5 min×2次；4℃保存待用. ② 样品制备： 将爬片依次经乙腈梯度脱水；真空干燥仪干燥，喷金，扫描电镜下观察. 1.2.7透射电镜观察① 样品制备： 将对数生长期各组的细胞制成悬液，离心成1 mm3细胞团，加入30 mg/L戊二醛，4℃固定2 h以上，0.01 mol/L PBS漂洗，5 min×2次；10 g/L锇酸后固定2 h, 0.01 mol/L PBS漂洗，5 min×2次；丙酮梯度脱水，浸透；Epon812包埋，65℃聚合24 h. 制备50 nm超薄切片，电子染色；② 透射电镜下观察. 统计学处理： 数据均以x±s表示，采用SPSS11.0统计软件进行析因设计方差分析，组间两两比较用LSDt检验，P<0.05认为差异有统计学意义. 2结果 2.1Hep G2细胞正常对照组之间A值差别不大， 照射6, 12, 24 h组与相应对照组有明显差异（Tab 1）. 135 Hz的ELF作用细胞后，Hep G2细胞周期发生了改变， 凋亡率升高(Tab 2). 表1135Hz ELF对Hep G2细胞活性的影响（略）表2细胞周期及凋亡率比较（略） 2.2电镜观察正常对照组细胞呈扁平状，细胞生长旺盛，核分裂相常见，细胞表面有丰富的微绒毛，符合肿瘤细胞形态特点（Fig 1A）. 照射24 h，细胞收缩，变圆，细胞表面出现大小不等的泡状隆起（Fig 1B）.透射电镜下， ① 6, 12, 24 h的正常对照组细胞呈圆形或椭圆型，体积大小不等，异型性明显，细胞表面微绒毛丰富，细胞之间可见桥粒连接（Fig 1C），符合肿瘤细胞形态特点. ② 6 h照射组，少量细胞变圆，表面微绒毛减少，部分细胞表面出泡，线粒体浓缩，部分滑面内质网扩张，胞浆及染色质发生浓缩，核膜腔轻度扩张，异染色质增多，发生边集（Fig 1D）. ③ 12 h照射组，部分细胞胞浆内轻度泡状隆起突出于细胞表面，胞浆及部分线粒体浓缩，异染色质边集（Fig 1E）. ④ 24 h照射组，胞浆及染色质浓缩，分解成大小不等，形态不一的有膜包绕的团块，突出于细胞表面，团块脱落形成凋亡小体（Fig 1F）. 3讨论 细胞增殖调控与肿瘤发生的密切关系已被人们所认识. 关于ELF 是否影响正常细胞以及肿瘤细胞的增殖、分化无疑成为研究的热点［6，7］. 我们在实验中，应用透射电镜观察135 Hz的ELF照射Hep G2细胞所发生的形态学变化，表明这种照射可抑制Hep G2细胞生长并促进其凋亡. 细胞发生凋亡有其独特的形态学特征［8,9］： 亚细胞水平上，染色质浓缩，核裂解，核膜完整. 胞浆浓缩，内质网扩张. 随着凋亡的进一步发展，染色质沿核膜聚集成块，扩张的内质网与细胞膜融合，细胞膜卷曲，分别包绕各种细胞器和细胞核的染色质，并以出芽的方式使细胞发生碎裂，形成凋亡小体. 本实验中，我们观察到了135 Hz的ELF照射所引发的Hep G2细胞发生凋亡的细胞超微结构改变，但考虑到体外实验的局限性，135 Hz的ELF的这一作用尚需在动物体内实验加以验证. 我们实验的结果表明 ，在所用的实验条件下，低频电磁场的生物学效应： 在细胞水平上，表现为抑制Hep G2细胞的增殖；在染色体 DNA水平上，表现为对细胞周期的影响，使细胞S期百分比降低，使细胞组滞于G1期. 可以认为，135 Hz的ELF可能是通过改变Hep G2细胞的周期从而影响细胞增殖的［24］. 本实验中也同时观察到低频电磁场对细胞凋亡的影响，低频电磁场作用以后，Hep G2细胞的凋亡比率增高，说明135 Hz的ELF促进了细胞凋亡. 增殖与凋亡是对立而统一的整体，细胞群体表现出来的生长减低的效应，应该是细胞生长受抑制与细胞凋亡的综合体现. 135 Hz的ELF能抑制Hep G2细胞增殖的部分原因可能是促进了细胞的凋亡. 【参考文献】 ［1］ Zhao M, Zimmermann A.Apotosis in human hepatocellular carcinoma and in liver cell dysplasia is correlated with p53 protein immunoreactivity ［J］. Clin Pathol, 1997;50(4):394-400. ［2］ 徐高峰，刘青光，刘学民，等. 大鼠重症急性胰腺炎胰腺细胞凋亡的研究［J］. 第四军医大学学报,2003;24(10): 908-910. Xu GF, Liu QG, Liu QM, et al. Pancreatic acinar cell apoptosis in severe acute pancreastitis in rats ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24(10): 908-910. ［3］ Simko M, Kriehuber R, Weiss DG, et al. Effects of 50 Hz EMF exposure on micronucleus formation and apoptosis in transformed and nontransformed human cell lines ［J］. Bioelectromagnetics, 1998;19 (2):85-91. ［4］ Scorrano L, Oakes SA, Opferman JT, et al. BAX and BAK regulation of endoplasmic reticulum Ca2+: A control point for apoptosis ［J］. Science, 2003; 300(5616):135-139. ［5］ Trump BF, Berezesky IK. Calciummediated cell injury and cell death ［J］. FASEB J, 1995;9(2):219-228. ［6］ Loschinger M, Thumm S, Hammerle H, et al. Stimulation of protein kinase A activity and induced terminal differentiation of human skin fibroblasts in culture by lowfrequency electromagnetic fields ［J］. Toxicol Lett, 1998;95( 9697):369-376. ［7］ Tofani S, Barone D, Cintorino M, et al. Static and ELF magnetic fields induce tumor growth inhibition and apoptosis ［J］. Bioelectromagnetics, 2001;22(6):419-428. ［8］ Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease ［J］.Science, 1995;267(5203):1456-1462. ［9］ Kerr JFR, Winterford CM, Harmen BV. Apopotis:Its significance in cancer and cancer therapy ［J］. Cancer, 1994;73:2013-2020 |
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