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腺病毒介导KDR启动子的胸苷激酶基因治疗小鼠人鼻咽癌模型           ★★★ 【字体：小 大】
腺病毒介导KDR启动子的胸苷激酶基因治疗小鼠人鼻咽癌模型
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-1    
【关键词】  鼻咽肿瘤
　　Adenovirusmediated herpes simplex virus thymidine kinase gene transfer under the driving of KDR promoter in  treatment of experimental human nasopharyngeal  carcinoma in nude mice
　　【Abstract】 AIM: To investigate the therapeutic efficacy of adenovirusmediated herpes simplex virus thymidine kinase (HSVtk) gene transfer under the driving of KDR promoter (AdKDRtk) in combination of ganciclovir(GCV) against  human nasopharyngeal carcinoma(NPC) in nude mice. METHODS: CNE2 cell line was implanted subcutaneously into 36 nude mice, which were subsequently divided into 3  groups (n=12 each group): AdKDRtk/GCV group, AdCMVtk/GCV group (under the driving of CMV promoter) and saline/GCV group. Then the selective intratumoral injection of recombinant adenovirus or saline was performed in all nude mice，and repeated 24 h later. For the following 10 d GCV was given at a dose of 100 mg/（kg・d）, ip. All the treated animals were killed to evaluate the tumor weight and the histopathological changes and the microvessel density of tumors after the treatment finished. RESULTS:  The tumor weight and microvessel density of the saline/GCV group, AdCMVtk/GCV group and AdKDRtk/GCV were （2.53±1.21）g and (17.78±2.12) /mm3, (1.81±0.84) g and (11.54±1.56) /mm3, (1.48±0.88) g and (9.87±2.18) /mm3 respectively. Growth and microvessel density of NPC was significantly inhibited in the AdCMVtk/GCV group and AdKDRtk/GCV group as compared with that in the saline/GCV group (P<0.05). AdKDRtk/GCV group showed more marked antitumor effect, compared with the AdCMVtk/GCV group (P<0.05). CONCLUSION: Intratumoral injection of AdKDRtk results in the marked inhibition of NPC growth in nude mice. It may be a new treatment approach for human NPC.
　　【Keywords】 nasopharyngeal neoplasms; KDR promoter; simplervirus; thymidine  kinase; adenovirus vector
　　【摘要】 目的： 研究腺病毒介导的KDR启动子单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)系统(AdKDR tk)结合丙氧鸟苷（GCV）对裸鼠人鼻咽癌的治疗作用. 方法：  建立人鼻咽癌裸鼠模型, 将36只成瘤鼠随机分成AdKDRtk/GCV组、AdCMVtk/GCV组和生理盐水/GCV组，每组12只. 采用瘤内注射分别给予重组腺病毒及生理盐水，24 h后重复注射1次. 次日起连续10 d每日ip GCV 1次，100 mg/kg. 治疗结束后处死裸鼠，检测肿瘤质量、组织形态学变化及肿瘤微血管密度. 结果： AdCMVtk/ GCV组裸鼠鼻咽癌瘤体质量（1.81±0.84）g及肿瘤微血管密度（11.54±1.56）个/mm3、AdKDRtk/ GCV组［分别为（1.48±0.88）g，（9.87±2.18）个/mm3］与生理盐水/GCV组［分别为（2.53±1.21）g，（17.78±2.12）个/mm3］相比差异有显著性 (P<0.05). AdCMVtk/ GCV组与AdKDRtk/ GCV组比较也存在显著差异(P<0.05).  结论： 癌灶内注射AdKDRtk对裸鼠人鼻咽癌生长具有明显抑制作用，为鼻咽癌的治疗提供新的方法.
　　【关键词】 鼻咽肿瘤；KDR启动子；单纯疱疹病毒属;胸苷激酶；腺病毒载体
　　0引言
　　鼻咽癌是头颈部常见恶性肿瘤之一，目前鼻咽癌的主要治疗手段仍然是放射治疗，对一些Ⅲ， Ⅳ期的患者，同时还采用化学治疗和其他综合治疗. 尽管放疗设备和技术的不断进步以及放化疗的综合运用，但鼻咽癌的5 a生存率仍徘徊于50%左右［1］. 为了提高鼻咽癌生存率，研究新的药物或治疗方式是临床亟待解决的问题. 随着基因治疗技术的不断进展，对恶性肿瘤进行基因治疗已成为研究的热点. 我们研究以腺病毒介导的KDR启动子单纯疱疹病毒胸苷激酶系统结合丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)对裸鼠鼻咽癌的治疗作用，为进一步开展靶向鼻咽癌血管的自杀基因疗法研究奠定实验基础.
　　1材料和方法
　　1.1材料带有HSVtk基因的由CMV启动子驱动的重组腺病毒(AdCMVtk)和带有HSVtk基因的由KDR启动子驱动的重组腺病毒（AdKDRtk）由北京大学深圳医院博士后工作站构建并提供［2］. GCV购自Roche公司，人鼻咽癌细胞株CNE2（中山大学肿瘤医院赠送）. Balb/c裸小鼠，4~6 wk龄，体质量18~22 g，雌雄不分，由中国科学院上海实验动物中心提供，饲养于SPF级无菌饲养室，自由摄取食物和水. 取对数生长期的鼻咽癌细胞CNE2，制成单细胞悬液，裸鼠单侧腋部皮下植入5×105（0.2 mL）CNE2细胞，以皮下结节直径超过0.5 cm为成瘤标准.
 
　　1.2方法取成瘤裸鼠36只，随机分成AdKDRtk/GCV组、AdCMVtk/GCV组和生理盐水/GCV组（对照组），每组12只. 治疗组癌灶内分别注射含 AdKDRtk和AdCMVtk重组腺病毒液0.1 mL. 对照组注射生理盐水0.1 mL. 24 h后重复注射1次. 次日起连续10 d每日ip GCV 1次，100 mg/kg. 治疗结束后处死裸鼠，取出肿瘤称其瘤质量，部分肿瘤组织用40 g/L福尔马林固定. 肿瘤生长抑制率(%)=(1-治疗组瘤质量/对照组瘤质量)×100%［3］. 标本固定后，经石蜡包埋切片，HE染色在光镜下观察肿瘤细胞坏死、凋亡以及炎性反应等改变. 免疫组化抗CD31检测肿瘤微血管密度，采3个视野微血管数取平均值，记数方法按Weider技术进行［4］.
 
　　统计学处理： 数据分析采用SPSS10 .0软件，多组间比较行单因素方差分析，两两比较行LSDt检验.
　　2结果
　　2.1裸鼠鼻咽癌的生长AdCMVtk/GCV组和 AdKDRtk/GCV组移植瘤的生长速度明显低于生理盐水/GCV组. AdCMVtk/GCV组抑瘤率为26.6%， AdKDRtk/GCV组抑瘤率为40.5%，经统计学处理，AdCMVtk/GCV组和 AdKDRtk/GCV组分别与生理盐水/GCV组相比较，差异明显(P<0.05， 表1),表明经AdCMVtk/GCV和 AdKDRtk/GCV处理后癌生长均受到明显抑制. AdCMV tk/GCV组与AdKDRtk/GCV组比较也存在显著差异(P<0.05).
　　表1各组对裸鼠鼻咽癌生长的抑制作用(略)
　　aP<0.05  vs生理盐水/GCV组,  cP<0.05 vs AdCMVtk/GCV组.
　　2.2 病理学癌细胞大小不等，体积大，呈多边形，胞质丰富，核大，深染，核分裂相多见，偶见瘤巨细胞，间质血管丰富. AdCMVtk/GCV组及AdKDRtk/GCV组鼻咽癌细胞形态与生理盐水/GCV组无明显区别，但瘤组织中有大量的细胞坏死灶和液化区，肿瘤中心部有囊腔形成，有少量炎性细胞浸润（图1）. 肿瘤微血管密度(个/mm3)，AdKDRtk/GCV组为9.87±2.18，AdCMVtk/GCV组为11.54±1.56个，生理盐水/GCV组为17.78±2.12,显示AdKDRtk/GCV组最低，AdCMVtk/GCV组次之，生理盐水/GCV组最多. 经统计学处理，各组肿瘤微血管密度相互之间具有显著性差异（P<0.05）.
　A：生理盐水/GCV组；　B：AdCMVtk/GCV组；　C：AdKDRtk/GCV组.
　　图1各组裸鼠移植瘤组织镜下变化HE  ×400(略)
　　3讨论
　　肿瘤自杀基因疗法要求自杀基因能选择性地在靶肿瘤细胞中表达，而不在正常细胞中表达，以最大限度地杀伤肿瘤细胞，最小限度地损伤正常组织. 利用肿瘤特异性基因调控元件可驱动自杀基因仅在特定的肿瘤细胞中表达［5］. 血管内皮细胞生长因子(VEGF)是目前所发现血管生成相关因子中最重要的血管生长因子. 其生物效应是通过其特异性受体（KDP）介导的. 单独阻止受体KDR即可控制VEGF介导的肿瘤的血管生成. 我们利用肿瘤与正常组织中血管内皮间KDR表达的差异性，设计了以KDR启动子调控由腺病毒介导的自杀基因HSVtk转移系统(AdKDRtk)，使其只在肿瘤血管内皮细胞中靶向表达，进而特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞. 结果显示， AdKDRtk/GCV组和AdCMVtk/GCV组对鼻咽癌的生长均显示一定的抑制作用. 癌内注射AdKDRtk后给予GCV可明显延缓裸鼠鼻咽癌生长，其效果不仅优越于AdCMVtk/GCV组处理的抗癌效应. 而且避免了CMV启动子非特异性活性使TK基因在全身细胞中广泛表达而产生的毒性作用［7］. 检测肿瘤微血管密度，结果显示AdKDRtk/GCV组最低，AdCMVtk/GCV组次之，生理盐水/GCV组最多. 说明pAdKDRtk自杀基因系统具有靶向肿瘤血管的高度特异性，自杀基因能在靶细胞中高度聚集并表达，在杀伤靶细胞使肿瘤缺血坏死发挥了良好的作用. 但是实验中发现AdKDRtk/GCV并未完全阻止肿瘤的生长，只是生长速度延缓，其可能原因除了剂量效应关系以及时间效应关系外，另一重要原因就是肿瘤的发生发展是在外部因素参与下多种基因共同作用的结果，故单基因治疗可能达不到理想的效果，需从多基因治疗方面考虑.
　　【参考文献】
　　［1］ 朱忠政，殷正丰，吴宗娣，等. 腺病毒介导的KDR启动子胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用［J］. 中国肿瘤生物治疗杂志，2001,8(4):243-247.
　　［2］ 刘晓平，李宝金，张 超. HSVtk基因治疗靶向载体的构建及特异性表达分析［J］．癌症，2006,25(2):179-184.
　　［3］  闵玲，周克元，梁统，等. Bclx1反义寡核苷酸对裸鼠人鼻咽癌移植瘤抑制作用的研究［J］. 中华肿瘤杂志，2004,26(1):15-16.
　　［4］  Brown LF, Tognazzi K, Dvorak HF, et al. Strong expression of kinase insert domain containing receptor, a vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor receptor in AIDS associated kaposis sarcoma and cutaneous angiosarcoma ［J］. Am J Pathol, 1996,148:1065-1074.
　　［5］  Greco O, Dachs GU. Gene directed enzyme/prodrug therapy of cancer. historical appraisal and future prospectives ［J］. J Cell Physiol, 2001,187(1):22-36.
　　［6］  Folkman J. The role of angiogenesis in tumor growth ［J］. Semin Cancer Biol, 1992,3:65-71.
　　［7］  Gerolami R, Cardoso J, Lewin M, et al. Evaluation of HSVtk gene therapy in a rat model of chemically induced hepatocellular carcinoma by intratumoral and intrahepatic artery routes［J］. Cancer Res, 2000,60(4):993-1001
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