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| VP22融合型显性负性突变体抑制乙肝病毒复制 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-1  |
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【关键词】 肝炎病毒 Inhibition of hepatitis B virus replication by dominant negative mutant of VP22 fusion protein 【Abstract】 AIM: To investigate the inhibitory effect on hepatitis B virus (HBV) replication with dominant negative (DN) mutant of VP22 fusion protein. METHODS: Fulllength or fractions of VP22 were fused to C terminal of HBV core protein (HBc), and cloned into pcDNA3.1(-) vector, yielding eukaryotic expression plasmids of DN mutant. After transfection into HepG2.2.15 cells, the expression of DN mutant was identified by immunofluorescence staining. The inhibitory effect of DN mutant on HBV replication was indexed as the concentration of HBV surface antigen (HBsAg) in the supernatant of cell culture. And MTT assay was performed to detect the cytotoxicity of transgene expression to the host cells. RESULTS: DN mutant of VP22 and its fractions could be expressed in HepG2.2.15 cells, and had no toxic effect on the host cells. The DN mutant could inhibit HBV replication, and the mutant with protein transduction ability had a stronger inhibition than that without. The DN mutant of fulllength VP22 had the strongest inhibitory effect, reducing the HBsAg concentration by 81.94%. CONCLUSION: DN mutant of VP22 fusion protein can enhance the inhibition of HBV replication. 【Keywords】hepatitis B virus; dominant negative mutant; VP22 【摘要】 目的： 了解VP22融合型显性负性(DN)突变体对抑制乙肝病毒(HBV)复制的作用. 方法： 将VP22全长及其不同区段融合于HBV核心蛋白(HBc)的C端，克隆入pcDNA3.1(-)构成DN突变体真核表达质粒. 转染HepG2.2.15细胞后，免疫荧光鉴定DN突变体在细胞内的表达，并以培养上清HBV表面抗原(HBsAg)的浓度为指标，观察DN突变体对HBV病毒复制的抑制效应. 同时以MTT比色法观察转基因的表达对宿主细胞生长状态的影响. 结果： VP22及其不同区段构建的DN突变体可在HepG2.2.15细胞中进行表达，且对宿主细胞无毒性. VP22融合型DN突变体可有效地抑制HBV的复制，具有蛋白转导特性的DN突变体比无转导特性的DN突变体具有更强的抗病毒能力. 其中VP22全长构成的DN突变体具有最强的抑制效应，可使上清HBsAg浓度下降81.94%. 结论： VP22融合型DN突变体可以增强DN突变体对HBV复制的抑制. 【关键词】 肝炎病毒，乙型；显性负性突变体；VP22 0引言 全球目前有3.5亿慢性乙型肝炎病毒（hepatitis virus B, HBV）感染者，每年约有100万人死于HBV感染的相关疾病，占疾病死因的第9位［1］. 目前，国际上尚无有效治疗慢性乙肝的手段. 基因治疗技术的不断发展为抗HBV治疗提供了新的思路和途径. 其中显性负性(dominant negative，DN)突变体的胞内表达是HBV基因治疗的重要策略之一［2-6］. Elliott等［7］发现，单纯疱疹病毒1(herpes simplex virus type 1, HSV1)的结构蛋白VP22(及其融合蛋白)可从培养基进入细胞内，并可不经过细胞细胞接触依赖性在同型或异型细胞之间转移. 我们将HBV核心蛋白(HBV core protein, HBc)与VP22进行融合构成DN突变体，以期利用VP22的蛋白转导特性进一步提高DN突变体的抗病毒效应. 1材料和方法 1.1材料质粒pVP22/mycHis2和pcDNA3.1(-)为Invitrogen公司产品；EBOHBV克隆有1.3倍HBV全长基因组为本室保存. 限制性内切酶、连接酶购自TaKaRa Biotech Co.Ltd；鼠抗HBc抗体和鼠抗cmyc抗体为SantaCruz公司产品，FITC标记的羊抗鼠IgG为武汉博士德生物工程有限公司产品；DMEM培养基、进口胎牛血清以及LipofectinMine2000购于GIBCO公司；固相放免定量分析HBsAg试剂盒为北京北免东雅生物技术研究所产品；其余化学试剂均为国产分析纯. 1.2方法 1.2.1寡核苷酸合成所有寡核苷酸的合成均由TaKaRa Biotech Co. Ltd完成. 下划线部分是为便于分子克隆操作而引入的限制性内切酶的识别序列，大写碱基为起始码或终止码. HBc1: 5′gcgcggtaccATGgacatcgaccctt3′ (KpnI)；HBc2:5′gcgcctcgagTCAggatccacattgaggttccc3′ (XhoI, BamHI)；US: 5′gcccggatccatgacctctcgctccgtg3′(BamHI)；UR: 5′ccccagatctatcgggactcgccatacc3′ (BglII)；DS: 5′gccgagatctgacgcggccacggcg3′ (BglII)；DR: 5′gggcctcgagTTAcagctaatcctcttctgag3′ (XhoI)；cmyc1: 5′gcccggatccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgTAActcgaggggc3′(BamHI, XhoI)；cmyc2: 5′gggcctcgagTTAcagatcctcttctgagatgagtttttgttcggatccgccc3′(XhoI, BamHI). 1.2.2细胞培养HepG2.2.15细胞整合有完整的HBV基因组，能持续转录和翻译HBV基因，产生HBsAg, HBeAg和Dane颗粒，由第四军医大学唐都医院传染科惠赠. 细胞在含有15 mL/L胎牛血清的DMEM培养基(含有终浓度为200 mg/L的G418)，37℃, 50 mL/L CO2条件下进行培养，2 d换液1次，6 d传代1次. 1.2.3载体构建本实验构建的载体主要有以下几种. pHBc： 以载体EBOHBV为模板，HBc1和HBc2为引物扩增HBc编码序列. PCR产物经KpnI/XhoI酶切后克隆入pcDNA3.1(-)，构成载体pHBc. ① pHVP22/M： 将合成的cmyc1和cmyc2均调至浓度为0.1 mmol/L，取等体积混匀，于100℃煮沸5 min并缓慢冷却至室温退火形成双链. 双链cmyc片段经BamHI/XhoI酶切后连入经相同酶切的pHBc质粒，形成pHVP22/M. ② pHVP22/F： 质粒pVP22/mycHis2为模板，US/DR为引物扩增VP22编码序列全长及cmyc表位. PCR产物经BamHI/XhoI酶切后连入经相同酶切的pHBc质粒，形成pHVP22/F. ③ pHVP22/U： BamHI单酶切质粒pHVP22/M并进行脱磷酸化处理. 以pVP22/mycHis2为模板，US/UR为引物扩增VP22编码区上游102 bp的片段，用BamHI/BglII酶切后连入pHVP22/M的BamHI位点. 经鉴定为正向连接形成的质粒命名为pHVP22/U. ④ pHVP22/D： 以pVP22/mycHis2为模板，DS/DR为引物扩增VP22编码区下游102 bp的片段. PCR产物经BamHI/XhoI酶切后连入经相同酶切的pHBc质粒，形成pHVP22/D. 1.2.4细胞转染参考GIBCO公司的LipofectinMine2000转染技术手册，将细胞以2×108/L接种于12孔培养板，每孔500 μL, 24 h后进行转染. LipofectinMine 2000 5 μL/孔，DNA为6 μL/孔. 转染分为7组：pHVP22/F, pHVP22/U, pHVP22/D, pHVP22/M, pHBc, pcDNA3.1(-)和空转染组，每组设3个复孔. 1.2.5转基因表达的检测HepG2.2.15细胞以2×108/L接种于内置有盖玻片的6孔培养板，细胞转染48 h后将细胞置于冰上，吸取上清于-20℃冻存. 用PBS (4℃，pH 8.0)洗涤贴壁细胞，弃去PBS，以20 g/L多聚甲醛和1 g/L Triton固定后于冰上放置30 min. PBS洗涤2次，每次5 min，加入1 mL用10 mL/L BSA/PBS 1∶50稀释的鼠抗HBc抗体(或cmyc抗体)，4℃湿盒过夜. PBS同上洗涤后加1 mL 1∶80稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，PBS再次洗涤后以500 mL/L甘油的PBS封片，荧光显微镜下观察并照相. 1.2.6抗病毒效应分析为分析转染基因的抗病毒效应，转染HepG2.2.15细胞后留取上清，应用北京北免东雅生物技术研究所的固相放免定量分析HBsAg试剂盒进行上清HBsAg含量的测定. 由第四军医大学西京医院核医学科测定包被珠的放射性计数，以每分钟计数(countings per minute，CPM)表示，利用标准品的CPM值与浓度求出直线回归方程，据此得出各样品浓度. 1.2.7细胞毒性检测应用MTT比色法测定转染引起的细胞毒性作用. 细胞转染后48 h，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO终止培养，振荡10 min，使结晶物充分溶解. 于酶联免疫检测仪检测A490 nm，记录结果. 统计学处理： 数据用x±s表示，采用SPSS 11.0进行单因素方差分析以及LSDt检验. P<0.05认为差异有统计学意义. 2结果 2.1载体构建的鉴定为使HBc的DN突变体发挥更强的抗HBV作用，将VP22融合于HBc的C端，构成载体pHVP22/F. 已有研究表明［8］，VP22的转导活性结构域位于C端(由102 bp编码)，因此将该结构域融合于HBc的C端(pHVP22/D)，观察与VP22全长融合型DN突变体抗HBV效应的差别. 其他载体为缺乏转导性能的对照载体. 实验中所用质粒载体均以通用引物测序证明构建正确，且序列及读框均无错误. 测序由上海基康生物工程公司完成. 2.2转基因表达的检测为检测各种DN突变体在HepG2.2.15细胞内的表达情况，转染后分别以抗HBc抗体和抗cmyc抗体做免疫荧光分析. 结果发现，以抗HBc抗体检测时，pcDNA3.1(-)和空转染组没有荧光出现(图1)；以抗cmyc抗体检测时，pHBc, pcDNA3.1(-)和空转染组没有荧光出现. 其余各组均有较强的荧光出现. 证明转染基因在细胞内有表达，且可被相应的抗体识别，提示表达的融合蛋白的折叠没有影响各组分蛋白的功能. 图1间接免疫荧光检测转基因在HepG2.2.15细胞中的表达（略） 2.3抗病毒效应分析为确定VP22融合型DN突变体对HBV复制的抑制作用，我们以HepG2.2.15转染细胞上清中HBsAg浓度为指标进行检测. 结果表明，与空转染组相比，pHVP22/F, pHVP22/U和pHVP22/D转染组的HBsAg浓度分别下降了81.94%, 38.88%和63.89% (图2)，具有显著性统计学差异(P<0.05)；其他各组与空转染组相比无显著性差异. 说明VP22融合型DN突变体可有效地抑制HBV的复制. aP<0.05 vs MOCK; cP<0.05 vs pHVP22; eP<0.05 vs pHVP22/D. 图2各转染组HBsAg浓度的比较（略） 此外，pHVP22/F, pHVP22/U和pHVP22/D组间差别也具有明显统计学意义(P<0.05). 对所融合VP22片段分析发现，具有蛋白转导特性的DN突变体(pHVP22/F和pHVP22/D)比无转导特性的DN突变体(pHVP22/U)具有更强的抗病毒能力(P<0.05)，而与融合了VP22全长的DN突变体(pHVP22/F)相比，仅含有蛋白转导域的DN突变体(pHVP22/D)对病毒复制的抑制效应要小(P<0.05, 图2). 由cmyc表位编码区构成的DN突变体(pHVP22/M)与空转染组相比无明显差异(P>0.05)，即对HBV病毒复制没有抑制性作用. 2.4细胞毒性检测转染后48 h，于倒置显微镜下观察细胞的形态和生长状态，发现各转染组细胞生长状态良好，无异常形态. MTT比色分析的统计结果也显示，各组之间无显著性差异(P>0.05)，进一步提示DN突变体的表达对宿主细胞的生长没有影响(表1). 表1MTT比色测定结果（略） 3讨论 HBV感染是一个世界范围的卫生问题，我国是病毒性肝炎的高发区，针对HBV感染的治疗一直是研究的重点之一. 但HBV前C基因的变异、YMDD位点的多聚酶变异造成的耐药性［9-10］，给HBV抗感染治疗带来很大的困难. 基因工程技术的发展，使得基因治疗在抗HBV感染研究中具有更加重要的地位. DN突变体即是基因治疗HBV感染的重要策略之一. 将突变失活的特定基因导入受染细胞，与野生型基因产物进行竞争以抑制其活性，从而达到抑制病毒复制的作用. 该方法以蛋白作为效应分子，回避了以核酸为效应分子时遇到的HBV变异问题，因而成为具有优势的一种治疗策略. 但是，在基因治疗时，往往因为没有足够的治疗分子达到靶细胞而不能起到较好的治疗作用，本研究以具有蛋白转导特性的VP22蛋白与HBc融合构成DN突变体，以期利用VP22的蛋白转导性能提高治疗效果，弥补治疗分子数量的不足. VP22是HSV1的一种结构蛋白，具有很强的细胞间转移作用，可将与其融合的蛋白分子高效地带入其转移的细胞［7］. 具有蛋白转导活性的结构域(protein transduction domain, PTD)位于VP22蛋白C端的34氨基酸，与这段序列融合的蛋白分子也可以被带入转移细胞. 本研究中VP22蛋白C端的34个氨基酸(即PTD)与HBc构成的DN突变体可使HBsAg浓度下降63.89%，而N端的34个氨基酸形成的DN突变体仅为38.88%，表明含有PTD的突变体比不含PTD突变体的抑制能力强，VP22的蛋白转导性能可增强DN突变体作用. 此外，以VP22全长构成的DN突变体(pHVP22/F)可使HBsAg浓度下降81.94%，与VP22的PTD构成的DN突变体(pHVP22/D)相比具有显著差异(P<0.05). 由于二者均含有PTD而抑制效率不同，提示在构建DN突变体时HBc的C端融合的分子大小与其病毒抑制能力有关，融合的分子越大其效应越强，原因可能是较大的融合蛋白一方面具有较好的稳定性，另一方面可形成必要的空间位阻以抑制天然HBc形成核衣壳. 值得注意的是当在HBc的C端只融合了cmyc表位(pHVP22/M)时，该DN突变体不具有抑制HBV复制的能力，由于cmyc表位仅有10个氨基酸，推测HBc的DN突变体在发挥病毒抑制作用时其C端融合分子的大小有一个最小值，相关的实验目前正在进行中. 尽管融合较大的蛋白形成DN突变体具有更好的病毒抑制能力，而且本研究也证明了所构建的DN突变体对于宿主细胞的生长没有影响，但是在实际应用中，VP22毕竟是一种外源性蛋白分子，对于机体其他细胞尤其是免疫系统细胞是否存在影响仍然需要做很多工作. 基因治疗HBV感染虽然目前仍很不成熟［11］，但为乙肝的治疗开辟了一个新天地，提供了新思路. 【参考文献】 ［1］Pramoolsinsup C. Management of viral hepatitis B［J］. J Gastroenterol Hepatol, 2002,17(Suppl):S125-S145. ［2］von Weizsacker F, Kock J, Wieland S, et al. Dominant negative mutants of the duck hepatitis B virus core protein interfere with RNA pregenome packaging and viral DNA synthesis［J］. Hepatology, 1999,30(1):308-315. ［3］von Weizsacker F, Wieland S, Kock J, et al. Gene therapy for chronic viral hepatitis: Ribozymes, antisense oligonucleotides, and dominant negative mutants［J］. Hepatology,1997,26(2):251-255. ［4］Scaglioni P, Melegari M, Takahashi M, et al. Use of dominant negative mutants of the hepadnaviral core protein as antiviral agents［J］. Hepatology,1996,24(5):1010-1017. ［5］von Weizsacker F, Wieland S, Blum HE. Inhibition of viral replication by genetically engineered mutants of the duck hepatitis B virus core protein［J］. Hepatology,1996,24(2):294-299. ［6］Scaglioni PP, Melegari M, Wands JR. Characterization of hepatitis B virus core mutants that inhibit viral replication［J］. Virology,1994,205(1):112-120. ［7］Elliott G, OHare P. Intercellular tranfficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein［J］. Cell, 1997,88:223-233. ［8］Schwarze SR, Dowdy SF. In vivo protein transduction: Intracellular delivery of biologically active proteins, compounds and DNA ［J］. Trends Pharmacol Sci,2000,21:45-48. ［9］Ling R, Mutimer D, Ahmed M. Selection of mutations in the hepatitis B virus polymerase during therapy of transplant recipients with lamivudine ［J］. Hepatology, 1996,24:711-713. ［10］Tipples GA, Ma MM, Fischer KP. Mutations in HBV RNAdependent DNA polymerase confers resistance to lamivudine in vivo［J］. Hepatology, 1996,24:714-717. ［11］Guha C, Shah SJ, Ghosh SS, et al. Molecular therapies for viral hepatitis［J］. Biol Drugs, 2003,17:81-91 |
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