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| 慢性马兜铃酸肾病大鼠模型肾组织中蛋白质组的差异表达 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-9-30  |
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【关键词】 马兜铃酸；大鼠；肾组织；双向聚丙烯酰胺凝胶电泳；蛋白质组 Differentially expressed proteins in renal tissues of rat models of chronic aristolochic acid nephropathy 【Abstract】 AIM: To establish the 2dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D PAGE) profiles from aristolochic acid nephropathy (AAN) rat renal tissues and normal renal tissues and to identify the differentially expressed proteins. METHODS: Establish chronic renal interstitial fibrosis model in rats by peritoneal injection with aristolochic acid (AA). The total proteins from AAN models and normal rat renal tissues were separated by 2D PAGE. The differentially expressed proteins in 2DPAGE maps were analyzed using image analysis software. RESULTS: The rat models of AAinduced chronic renal interstitial fibrosis were established successfully. Clear, wellresolved and reproducible 2D PAGE patterns of AAN models and normal rat renal tissues were obtained and many differentially expressed proteins were found. CONCLUSION: The differentially expressed proteins of renal tissues can be induced by AA in Wistar rats. These proteins maybe mediate the toxicity of aristolochic acid to renal tissues. 【Keywords】 aristolochic acid; rats; renal tissues; 2D PAGE; proteome 【摘要】 目的： 制备慢性马兜铃酸肾病的大鼠模型，建立马兜铃酸肾病大鼠肾组织和正常大鼠肾组织的双向电泳图谱，从而展示差异表达的蛋白质，为进一步筛选介导马兜铃酸毒性作用的蛋白质分子奠定基础. 方法：应用马兜铃酸腹腔注射制备大鼠慢性马兜铃酸肾病模型，提取其肾组织中总蛋白质，采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，对模型组和正常组肾组织中蛋白质进行差异展示. 结果：成功制备了慢性马兜铃酸肾病大鼠模型，并建立了模型组和正常组大鼠肾组织的双向电泳图谱，发现了差异蛋白质. 结论：马兜铃酸导致大鼠肾组织中蛋白质差异表达，这些差异表达的蛋白质可能介导了马兜铃酸的毒性作用. 【关键词】 马兜铃酸；大鼠；肾组织；双向聚丙烯酰胺凝胶电泳；蛋白质组 【中图号】 R587.1 0引言 自Vanhrweghem等［1］报道了因减肥药引起“中草药肾病（Chinese herbs nephropathy，CHN）”以来，含马兜铃酸成分的中草药所致的肾损害马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephropathy，AAN）越来越受到了国内外学者的广泛重视. 由于一些常用中草药及中成药都含有马兜铃酸，因而由马兜铃酸引起的肾损害在临床上十分常见［2］. 急性AAN主要表现为急性肾小管坏死，慢性AAN表现为寡细胞性肾间质纤维化［2-3］，病情多为不可逆性，而且即使停服药物，其肾损害仍然继续进展［4-5］. 绝大多数患者很快或逐渐进入终末期肾衰，需要肾脏替代治疗. 因此阐明马兜铃酸肾损害的分子机制，以进行早期的诊断和治疗（在蛋白质或基因水平进行干预和阻断）将是缓解马兜铃酸肾损害的关键. 为此，我们建立慢性马兜铃酸肾病模型，用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选和比较马兜铃酸诱导的差异蛋白质分子，为马兜铃酸导致肾损害的分子靶点研究奠定基础. 1材料和方法 1.1材料雌性Wistar大鼠，20～24 wk龄，体质量190～210 g（第四军医大学实验动物中心）；马兜铃酸制剂：用马兜铃酸标准品（中国生物制品研究所提供）配制成0.5 g/L的溶液,高压灭菌, 置冰箱4℃下保存备用. 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS、三（羟甲基）氨基甲烷、苯甲基磺酰氟（华美生物工程公司）；超纯尿素（上海生物工程公司产品）；两性电解质pH 5～8（上海丽珠东风技术有限公司）；DYYⅢ26型双向电泳槽和梯度混合器（北京六一厂）；电泳仪（BioRad公司）. 1.2方法 1.2.1慢性马兜铃酸肾病动物模型的建立根据文献［6］进行，将Wistar大鼠随机分为2组. 马兜铃酸组（n=30）：每只大鼠腹膜内注射马兜铃酸,剂量为5 mg/(kg・d)，共16 wk. 在用药开始后第8，12，16，20，24 wk分别处死6只大鼠. 正常对照组（n=5）：每只大鼠腹膜内注射生理盐水2 mL/d，共16wk，在第24 wk实验结束时处死. 大鼠在处死时留取肾脏标本，-70℃冰箱保存，用以作肾脏病理检查. 1.2.2蛋白质样品的准备在用药开始后第12 wk处死大鼠，取其肾脏，具体方法为：将大鼠乙醚麻醉，开腹，分离出鼠双侧肾脏，自肾动脉用冰生理盐水在体对肾脏进行灌注直至肾脏发白，取出肾脏用滤纸吸去多余液体，然后用电子天平称质量后，按照比例加入组织裂解液，冰浴上匀浆，静置，离心，用Lowry法测定上清液中总蛋白含量，吸取上清液分装，-70℃冻存. 1.2.3双向电泳（2D PAGE）首先进行等电聚焦(IEF)：取17 cm IPG胶条(pH 5～8)在加有样品的泡涨液中以被动式泡涨12～16 h，用PROTEAN IEF Cell等点聚焦仪进行第一向电泳. IEF结束后，IPG胶条置含有DTF的平衡液中；然后进行SDSPAGE电泳：预先制备垂直电泳用凝胶，将进行完IEF并平衡后的胶条转移至凝胶的上方，用10 g/L热琼脂糖溶胶封固. 在PROTEAN II Xi垂直电泳槽的上下槽中加入电极缓冲液后按照预设程序进行电泳，直至溴酚蓝前沿距下缘0.5 cm时停止电泳. 最后参照BioRad推荐的硝酸银染色方法进行染色. 凝胶通过Imagescanner扫描仪以及LabScan扫描软件进行扫描获取图像，利用PDQUEST图像分析软件对电泳结果进行分析，图像分析包括蛋白质斑点的检测、编辑、背景扣除和点的匹配等. 统计学处理： 所有数据的统计分析在SPSS 10.0软件和Excel上进行. 2结果 2.1慢性马兜铃酸肾病模型的鉴定马兜铃酸组用药后8 wk，肾小球、肾小管间质、肾血管均未见损害；用药后12 wk，肾小球未见改变，部分肾小管上皮细胞发生空泡变性；用药后16 wk，肾脏近曲小管上皮细胞明显肿胀，管腔缩小，并伴有部分肾小管上皮细胞坏死及凋亡；20 wk时肿胀的小管上皮细胞逐渐缩小，部分远曲小管出现扩张，个别肾小管萎缩，但未见间质出现纤维化；24 wk时可见较多肾小管出现萎缩，肾间质出现多灶性纤维化（图1）. 2.2马兜铃酸诱导的大鼠肾组织中蛋白质组的差异表达根据马兜铃酸处理后大鼠不同时间肾组织病理改变的结果提示，肾脏于12 wk开始出现早期的病变，因此取12 wk时的肾组织进行双向电泳. 在二维平面上将小鼠肾脏组织蛋白质进行分离，得到2D电泳图谱（图2），正常对照组和马兜铃酸肾病模型组的匹配率为83.4%，有大量蛋白质点相对含量增加或降低，或新出现，其中87个蛋白质点在模型组比正常组上调2倍，18个蛋白质点上调5倍以上，73个蛋白质点下调2倍. 部分表达差异的蛋白点数据见表1，其中蛋白质点1271，1823和2001在正常组弱表达，而在模型组高表达；蛋白质点1567和1789在正常组中无表达，而在模型组出现表达；蛋白质点1398在模型组中表达低于正常组. 图1正常对照组和马兜铃酸组大鼠肾组织Masson ×400（略） 图2马兜铃酸大鼠肾组织的双向电泳图（略） 表1正常组和马兜铃酸肾病模型组部分差异蛋白质点（略） 3讨论 我国学者早在1964年就发现了木通致急性肾衰（ARF）的病例，但由于仅为个例报道，无临床与病理分析，故未引起重视. 由于一些常用中草药及中成药都含有马兜铃酸，如关木通、广防己、青木香、天仙藤、马兜铃、寻骨风、朱砂莲及龙胆泻肝丸、二十五味松石丸、十香返生丸、大黄清胃丸、小儿金丹片、止咳化痰丸、分清五淋丸、安阳精制膏、导赤丸、妇科分清丸、纯阳正气丸、冠心苏合丸、排石颗粒、跌打丸等，因而由马兜铃酸引起的肾损害在临床上十分常见. 北京中日友好医院报道，由马兜铃酸引起的慢性AAN占其全科慢性肾小管间质疾病的80%，此病很可能是我国最常见的慢性肾小管间质疾病［2］, 目前尚无有效的治疗. 因此，寻找出马兜铃酸导致肾脏损害的始动分子，进而早期诊断和治疗（在蛋白质或基因水平进行干预和阻断）将是解决马兜铃酸肾损害的关键，也正是我们的研究目标. 差异蛋白质组学是蛋白质组学研究的重要方面，它是着重于寻找和筛选多个样本之间的差异蛋白质谱,揭示细胞生理和病理状态的进程与本质、对外界环境刺激的反应途径以及细胞调控机制,同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，因此差异蛋白质组学为一些疾病的病因学和治疗学的研究提供了很好的思路. 双向凝胶电泳和质谱技术是当前分离鉴定蛋白质的两大支柱技术. Kennedy［7］利用蛋白质组学技术研究了庆大霉素处理组蛋白质所发生的特异性的变化，结果得到了一些新的蛋白质标志物. Aicher等［8］利用该技术分析了环孢菌素A处理后鼠的肾脏，鉴别出一种新的钙结合蛋白，而该蛋白可能作为肾脏毒性的一个新的标志物. 差异蛋白质组学的研究同样也适用于中药毒性分子靶点的筛选和鉴定. 为此，我们在建立慢性马兜铃酸肾病模型的基础上用双向电泳技术筛选和比较模型动物肾组织中马兜铃酸诱导的差异蛋白质分子，为进一步寻找马兜铃酸导致肾损害的分子靶点奠定基础. 我们利用双向电泳系统，对马兜铃酸诱导肾间质纤维化早期（12 wk）大鼠模型的肾组织和正常大鼠肾组织进行蛋白差异展示，软件分析显示双向电泳图谱的匹配率可达83.4%，同时出现差异明显的蛋白质点，提示这些差异表达的蛋白质可能参与马兜铃酸肾损害早期过程，可能是毒性作用的始动分子. 我们还需对这些差异蛋白质分子进行质谱鉴定及功能研究，才能寻找出真正介导马兜铃酸毒性作用的蛋白质分子. 【参考文献】 ［1］ Vanherweghem JL, Depierreux M, Tielemans C, et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs［J］. Lancet, 1993,341(8842):387-391. ［2］ 陈文, 谌贻璞, 李安, 等. 马兜铃酸肾病的临床与病理表现［J］. 中华医学杂志, 2001,81(18): 1101-1105. ［3］ 陈文, 谌贻璞. 马兜铃酸肾病［J］. 中华内科杂志,2001,40:426-427. ［4］ 尹广, 胡伟新, 黎磊石. 木通中毒的肾损害［J］. 肾脏病与透析肾移植杂志, 1999,8:10-14. ［5］ Strihou C, Vanherweghem JL. The tragic paradigm of Chinese herbs nephropathy［J］. Nephrol Dial Transplant,1995,10(2):157-160. ［6］ 郑法雷,张晓明,黄庆元. 慢性马兜铃酸肾病动物模型的建立及其意义［J］. 中华医学杂志, 2001,81:1095-1100. ［7］ Kennedy S. Proteomic profiling from human samples: the body fluid alternative［J］. Toxicol Lett, 2001,120(13):379-384. ［8］ Aicher L, Wahl D, Arce A, et al. New insights into cyclosporine A nephrotoxicity by proteome analysis［J］. Electrophoresis, 1998,19(11):1998-2003 |
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