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| 重症急性胰腺炎大鼠DDFA对肺损伤细胞凋亡及Bax, Bcl | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-9-30  |
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【关键词】 危重病；急性病；胰腺炎；肺/损伤；细胞凋亡；DDFA 【Abstract】 AIM: To explore the effects of DDFA on cell apoptosis and expressions of Bax and Bcl2 in lung tissue of rats with severe acute pancreatitis(SAP). METHODS: 45 rats weighting 200250 g were randomized into 3 groups: control group (n=15), SAP group (n=15) and DDFA group (n=15). The models of SAP were established by the injection of 200 g/L arginine solution ip（once a hour for 2 h） into the rats. At the 24, 48 and 72 h after establishment of models, serum amylase, TNFa and calcium were determined. The left lungs were taken for light and electron microscopic observation. Cell apoptosis in lung tissue was determined by TUNEL method. Expressions of Bax and Bcl2 were detected by immunohistochemical staining of SABC. RESULTS: In the SAP group, serum amylase, TNFa, apoptotic index, expressions of Bax and Bcl2 markedly increased. Lung tissue injuries were significant under a light microscope. As compared with SAP group at the same phase, serum amylase, TNFa, apoptotic index and expressions of Bax in DDFA group decreased significantly. While the expression of Bcl2 increased significantly. The injury of lung tissue was relieved by DDFA. CONCLUSION: The apoptosis and the expressions of Bax and Bcl2 in lung tissue might be involved in pathogenesis of SAP. DDFA administration in the early stage is helpful for diminishing lung injury induced by SAP. 【Keywords】 critical illness; acute disease; pancreatitis; lung/injuries; apoptosis; DDFA 【摘要】 目的： 探讨DDFA对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肺组织内细胞凋亡及Bax,Bcl2基因表达的影响. 方法： 大鼠45只随机分为对照组（CG）， SAP组和DDFA治疗组，每组15只. 大鼠SAP模型采用分2次ip 200 g/L精氨酸溶液方法建立，建模后24, 48和72 h时测定血清TNFa，淀粉酶. 血钙及光镜观察肺组织病理变化，细胞凋亡原位检测(TUNEL)法测定肺组织内细胞凋亡，SABC免疫组化染色法测定肺组织Bax, Bcl2基因表达. 结果： SAP组血清淀粉酶, TNFa和肺组织内细胞凋亡指数, Bax, Bcl2基因表达较CG组升高，光镜下见肺组织损害明显；经DDFA治疗后，血清淀粉酶, TNFa和肺组织内细胞凋亡指数, Bax基因表达下降，而Bcl2基因表达增强，光镜下见肺组织损害减轻. 结论： 肺组织细胞凋亡, Bax, Bcl2基因表达参与SAP发病机制，在SAP早期给予DDFA治疗对减轻肺脏损害是有益的. 【关键词】 危重病；急性病；胰腺炎；肺/损伤；细胞凋亡；DDFA 0引言 重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)常并发多器官功能障碍，其胰外器官损伤中肺损伤最为常见，称之为： 急性胰腺炎相关性肺损伤［1］，其发病机制尚不完全清楚. 1997年方驰华等［2］应用DDFA方案(D： dexamethasone； D： dextran； F： 5Fluorouracil； A： Appotininum)治疗SAP取得明显效果. 我们利用SAP肺脏损害大鼠模型，探讨细胞凋亡和Bax, Bcl2基因表达在SAP肺脏损害发病机制中的作用以及应用DDFA治疗后的影响. 1材料和方法 1.1材料SD大鼠45只，雌雄不限，体质量200~250 g，由南方医科大学实验动物中心提供；L精氨酸,分析纯级(Larginine)购自上海华美生物工程公司；血清淀粉酶测定试剂盒购自四川迈克科技有限公司；血清TNFα检测试剂盒购于北京北方生物技术研究所；细胞凋亡原位检测(TUNEL)试剂盒购自武汉博士德公司；SABC免疫组化染色法试剂盒购自武汉博士德公司. 1.2方法随机分成3组：对照组(CG组), SAP组和DDFA治疗组，每组15只. 每组再分为24，48和72 h 3个时间点，每个时间点分配5只大鼠. 实验前大鼠禁食12 h,自由饮水. SAP组大鼠分2次ip 200 g/L精氨酸溶液(2×2.5 mg/g)，中间间隔1 h；CG组同法注射等量的生理盐水；DDFA组分别在SAP模型诱发后12，24和36 h，经颈静脉注射地塞米松(2 mg/kg)+低分子右旋糖酐(5 mL/ kg)+5氟脲嘧啶(20 mg/ kg)+抑肽酶(50 000 U/kg)；SAP组分别在同一时间点注射等量生理盐水. 造模后24，48和72 h等各时间点处死大鼠，心脏穿刺抽血，快速切取肺脏，测定各项指标. 血清淀粉酶测定，按照说明书操作，采用放射免疫方法进行血清TNFα检测，由r计数仪直接给出有关参数、样品浓度. 各组织光镜标本以多聚甲醛固定，常规石蜡包埋,HE染色，光镜观察. 1.2.1肺组织细胞凋亡的测定采用DNA末端TUNEL法. 切片常规脱蜡入水，经30 mL/L H2O2处理、蛋白酶K消化后，加入TdT和DIGUTP 4℃过夜，封闭后加生物素化抗地高辛抗体，洗涤，加SABC，DAB显色，光镜下计算肺组织内细胞凋亡指数(apoptotic andex，AI). AI计算方法：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞，数5个高倍视野，分别计算凋亡细胞数和总细胞数，AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%. 1.2.2肺组织Bax, Bcl2的测定采用SABC免疫组化染色法. 染色模式： 胞膜或胞质. 根据染色强度分为： 阳性(棕黄色)；弱阳性(浅黄色)；阴性(不着色). 各组切片均采用图像分析系统对免疫组化染色阳性反应产物进行定量分析. 取切片在光学显微镜下以相同倍数（40×10）于肺组织内随机选取10个视野，利用图像分析系统分析阳性面积和阳性区域平均灰度值，并将阳性面积和平均灰度值按文献［3］方法换算成阳性单位(positive unit， PU)，以PU值大小代表阳性产物表达的多少. 统计学处理： 采用SPSS10.0统计软件建立数据库，组间均数比较用完全随机设计资料的方差分析，两两比较用SNK法，组间方差不齐时用非参数秩和检验，细胞凋亡与肺损害的相关性用相关分析. P<0.05为有显著性差异. 2结果 2.1肺组织病理学改变CG组未见异常. SAP组24 h胸腔见少量渗液，肺脏轻度水肿；48 h胸腔渗液增多，肺脏充血水肿加重，并可见少量出血点，淡红色；72 h肺组织充血水肿更为明显，可见局灶性坏死，胸腔渗液呈血性. DDFA组各时间点肺脏变化均较SAP组减轻. 光镜下CG组未见异常. SAP组大部分肺泡隔明显增厚，肺泡腔部分融合成肺大泡，部分萎缩，偶有炎性渗出；肺间质水肿、出血，大量炎性细胞浸润以中性粒细胞为主. DDFA组肺泡壁轻度增厚，肺泡内无渗出；肺泡毛细血管充血，间质可见少量红细胞浸出和少量炎性细胞浸润. 2.2血清淀粉酶和TNFa的改变检测结果显示,CG组血清淀粉酶和血清TNFα浓度正常；SAP时血清淀粉酶明显升高，且随着病程延长而逐渐增高，至48 h达峰值；DDFA组在应用DDFA治疗后，血清淀粉酶较SAP组明显下降（P<0.01，表1）. SAP组各时间点血清TNFa浓度明显升高，DDFA组血清TNFa浓度与SAP组比较明显下降（P<0.01，表1）. 2.3肺组织细胞凋亡情况CG组仅见极少量凋亡细胞（图1A），SAP组凋亡细胞明显增多，凋亡指数升高，并随着病程延长而逐渐增高，多为淋巴结内淋巴细胞和肺间质中的纤维母细胞等（图1B），DDFA组凋亡指数较SAP组明显下降(P<0.01，表1，图1C）. 肺组织内细胞凋亡与血淀粉酶呈正相关(r=0.537, P<0.05)，与血清TNFa也呈正相关(r=0.624, P<0.05). 表1大鼠血清淀粉酶值， TNFa和凋亡指数值 2.4肺组织细胞Bax和Bcl2的表达CG组Bax和Bcl2基因的表达均很弱；SAP组两基因的表达均明显增强，Bax基因在肺细胞的表达随着病程延长而逐渐增高（图2A），Bcl2基因表达值随着病程延长而逐渐下降（图2B），Bcl2/Bax比值较CG组下降，该比值也有随着病程延长而逐渐下降的趋势；DDFA组与SAP组比较，Bax基因表达明显下调（图2C），Bcl2基因表达明显上调（图2D），而Bcl2/Bax比值上升（表2）.表2大鼠肺脏细胞Bcl2, Bax基因表达和Bcl2/Bax比值 3讨论 SAP患者约1/3伴发肺损伤或急性呼吸窘迫综合症，1 wk内死亡者大约60%伴有肺损伤或急性呼吸窘迫综合症［3］. 因此，探讨肺损伤在SAP病情发展中的作用及发生机制，为其治疗提供新思路，具有重要意义. Tani等［4］首次报道ip过量L精氨酸能致大鼠SAP. 赵秋玲等［5］报道的L精氨酸诱导急性胰腺炎小鼠肺损伤指出该模型肺组织出现了肺间质水肿、炎细胞浸润、肺泡水肿和出血等肺损伤的表现. 我们采用L精氨酸诱导急性胰腺炎并发肺损伤大鼠模型同样显示胰腺和肺组织出现了典型的病理改变,表明分2次ip过量的L精氨酸可成功地诱导急性胰腺炎并发肺损伤的大鼠模型. 结果发现，SAP大鼠肺脏的细胞凋亡数明显增多，凋亡指数增高，凋亡发生部位与病理改变明显的部位吻合，肺脏细胞凋亡指数与血淀粉酶、TNFa的损害程度呈正相关. 我们发现，SAP时Bax基因表达明显上升，并且随病程延长而逐渐增高，Bcl2的表达也有所上升，但幅度相对较小，可能是机体代偿所致，且随病程延长而逐渐下降，因而Bcl2/Bax比值是下降的. 而应用DDFA治疗后，Bax基因表达明显下调，而Bcl2基因表达明显上调，Bcl2/Bax比值上升. SAP时随着肺脏凋亡细胞数增多、Bcl2/Bax比值下降，肺损伤进一步加重，DDFA可明显改善肺损伤的程度，并能调节Bcl2/Bax比例，减少肺脏细胞凋亡. 因此我们认为，DDFA对肺脏功能的保护作用可能部分是通过调节凋亡相关基因Bax和Bcl2,从而影响细胞凋亡实现的. 【参考文献】 ［1］ Hartwig W, Werner J, Jimenez RE, et al. Trypsin and activation of circulating trypsinogen contribute to pancreatitisassociated lung injury ［J］. Am J Physiol, 1999,277(5):1008-1016. ［2］ 方驰华,雷海录,戴永贵,等. DDFA治疗重症急性胰腺炎的临床研究［J］. 中华实验外科杂志, 1997,4(4):213-214. ［3］ Renner IG, Savage WT, Pantoja JL, et al. Death due to acute pancreatitis: A retrospective analysis of 405 autopsy cases［J］. Dig Dis Sci, 1985,30(10):1005-1018. ［4］ Tani S, Itoh H, Okabayashi Y, et al. A new model of acute necrotizing pancereatitis induced by excessive dose of arginine in rat ［J］. Dig Dis Sci, 1990,35(3):367. ［5］ 赵秋玲，黄承钰，黄英，等. L精氨酸诱导急性胰腺炎小鼠肺损伤的实验研究［J］. 四川大学学报： 医学版，2004,35（6）：839-842 |
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