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针对HER2/neu的siRNA对非小细胞肺癌细胞生长的抑制作用           ★★★ 【字体：小 大】
针对HER2/neu的siRNA对非小细胞肺癌细胞生长的抑制作用
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-9-30    
作者：任新玲，钱桂生，鲍炜，付海京，贾林涛，张瑞，王涛，许彦鸣，杨安钢
【关键词】  非小细胞肺
    Inhibition of tumor growth of nonsmall cell lung cancer by small interfering RNA targeting  to HER2/neu gene
　　【Abstract】 AIM: To construct RNA interference (RNAi) vector to downregulate HER2/neu gene and study the RNAi effect on the cell cycle and tumor growth of nonsmall cell lung cancer. METHODS: Oligonucleotides of 64 base pairs for hairpin RNA targeting HER2/neu were designed, chemically synthesized and annealed, and cloned into pSUPER vector．After identified by restriction digestion，the right vectors were transiently transfected into SPCA1 cells, a human lung adenocarcinoma cell line. The HER2 mRNA was detected by RTPCR, and the protein detected by  Western blot and indirect immunofluorescence staining. FCM analysis and MTT method were applied to measure cell cycle and cell growth respectively. RESULTS: SPCA1 cells had an overexpression of HER2. The vector of RNAi which can interfere HER2/neu gene was successfully constructed, and compared with parent cells, the vector can increase the number of cells in G0/G1 phase by 9.9%, and inhibit the tumor cell growth (P<0.05). CONCLUSION: We successfully constructed an expressing hairpin RNA against HER2/neu vector. The vector can effectively silence HER2/neu gene, increase the number of cells in G0/G1 phase, and then slow down the growth of tumor cells．This may be a useful therapeutic strategy for NSCLC overexpressing HER2/neu.
　　【Keywords】 siRNA; RNAi; carcinoma, nonsmallcell lung; HER2/neu
　　【摘要】 目的：构建针对HER2/neu的RNA干涉载体，观察对HER2/neu表达抑制及抑制后对非小细胞肺癌生长的影响. 方法：设计和合成长度为64nt的脱氧寡核苷酸链，退火互补成双链，克隆至pSUPER质粒载体，转化DH5α菌株，提取质粒，转染过表达HER2/neu的肺腺癌细胞系SPCA1，RTPCR检测HER2/neu的mRNA表达，Western blot和间接免疫荧光法检测HER2/neu的蛋白表达，FCM分析细胞周期变化，MTT法观察细胞生长. 结果：肺腺癌细胞系SPCA1存在HER2/neu过表达；成功构建了HER2/neu特异性RNA干涉载体pSUPERsiHER2；瞬时转染SPCA1细胞，HER2/neu的mRNA及蛋白表达均降低； G1期细胞较亲代增加9.9%；肿瘤细胞增殖速度减慢(P＜0.05). 结论：成功构建了HER2/neu RNA干涉载体，转染后可有效降低肺腺癌细胞系SPCA1 HER2/neu的mRNA转录及蛋白水平表达，阻滞转染细胞于G1期，造成转染细胞生长速度减慢，这有望为肺癌基因治疗提供一种选择手段.
　　【关键词】 siRNA；RNA干涉；癌,非小细胞肺；HER2/neu
　　0引言
　　
　　HER2/neu是由癌基因ErbB2/neu编码的具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白，分子量为185 ku, 属表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族，具有自动磷酸化作用. 乳腺癌、非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)等恶性肿瘤存在HER2/neu过表达，与肿瘤的发生、转移、血管形成及化疗耐药等有关［1-4］，本研究采用合成的编码针对HER2/neu siRNA的脱氧寡核苷酸模板序列，插入线性化pSUPER载体，把重组质粒转染过表达HER2/neu的肺腺癌细胞系SPCA1，观察转染后对HER2/neu mRNA转录和蛋白表达的抑制，及其对肺癌细胞周期及生长的影响.
　　1材料和方法
　　1．1材料pSUPER质粒和大肠杆菌DH5α菌种由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存；肺腺癌细胞系SPCA1由第四军医大学免疫学教研室保存； DNA Marker DL2000，LipofectamineTM 2000为Takara公司产品；细胞培养试剂、逆转录试剂盒、TRIZOL Reagent、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、ConcertTM Plasmid Midiprep System购自Gibco BRL公司；HER2/neu特异性单抗(小鼠抗人)购自neomarkers公司；FITC二抗(羊抗鼠)、辣根过氧化物酶（HRP）二抗(羊抗鼠，IgG)购自Transduction Laboratories公司.
　　1．2方法
　　1．2．1间接免疫荧光染色取制备好的过夜SPCA1细胞爬片，PBS洗涤，40 g/L多聚甲醛固定,3 g/L Triton100室温10 min，依此加入HER2一抗(含10 g/L BSA的PBS按1∶200稀释)4℃过夜， FITC二抗(1∶200稀释)室温1 h，DAPI室温3 min，荧光显微镜观察并照相.
　　1．2．2序列设计在NCBI数据库中查找人HER2/neu的mRNA全序列，提交发夹状RNA设计网站选择最佳干涉位点，本研究选取的靶位点是：547～566. 针对靶位点设计脱氧寡核苷酸序列如下：oligo1: 5′ gatcccctgatagacaccaaccgctcttcaagagagagcggttggtgtctatcatt
tttggaaa 3′；oligo2：是针对来源于深海水母的绿色荧光蛋白的一段序列，与人无同源性，做为无关序列对照(序列略)，由上海生工生物工程技术服务公司合成.
　　1．2．3脱氧寡核苷酸与pSUPER的连接与转化将合成的脱氧寡核苷酸序列退火、磷酸化成双链DNA； BglⅡ和Hind III双酶切pSUPER；连接酶连接pSUPER和磷酸化产物,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，铺于带有氨苄青霉素抗性的培养皿，37℃过夜，挑取重组质粒进行双酶切和DNA序列分析鉴定.
　　1．2．4细胞培养和质粒转染SPCA1细胞常规培养于含100 g/L FBS的RPMI 1640液，常规加：5×107 U／L青霉素，50 g／L链霉素. 取对数生长期贴壁细胞,使用LipofectamineTM 2000进行基因转染，按照说明书进行操作.
　　1．2．5RTPCR收集转染后72 h SPCA1细胞，Trizol reagent提取总RNA，用SuperScriptTM First Strand System for RTPCR试剂盒反转录，按照说明书进行操作. 以cDNA为模板对HER2/neu进行PCR扩增，扩增片断位于181~606 bp，按天为时代公司的一管便携式PCR试剂盒说明操作. 使用PCR上游引物P1:5′ ctgtttgccgtgccaccctgagt 3′, 下游引物P2: 5′ cttctgctgccgtcgcttgatgag 3′. 反应条件：95℃ 30 s变性，56℃ 20 s退火，72℃ 30 s延伸，30个循环. 10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物.
　　1．2．6Western blot收集转染后72 h SPCA1细胞，用含RIPA的裂解液提取总蛋白，BCA法蛋白定量，上样量40 μg/道，80 g/L SDSPAGE电泳，转移至NC膜，50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h，依次加入特异性HER2一抗(1∶800稀释) 4℃过夜，HRP二抗室温孵育1 h，增强化学发光法检测HER2/neu表达［5］.
　　1．2．7FCM检测细胞周期用10 g/L FBS培养细胞，收集转染后72 h SPCA1细胞，制成1×109/L单细胞悬液，PBS洗涤后注入750 mL/L的4℃乙醇固定，用含RNA裂解酶的PI对样品DNA荧光染色15 min，流式细胞仪(FCM)检测细胞周期.
　　1．2．8MTT法检测细胞增殖取对数生长期细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至2×107/L，按4×103/孔接种于96孔培养板，终体积200 μL/孔，100 g/L FBS培养细胞，分别于转染后24, 48, 72, 96和120 h加入20 μL MTT(5 g/L)/孔，4 h弃上清，加DMSO 150 μL 20 min，振荡15 min，在ELISA读数仪490 nm波长处测各孔吸光值(A). 每组设5个复孔，实验重复3次，绘制细胞增殖曲线.
　　统计学处理： 计量资料以x±s表示，组间比较采用SPSS软件包进行方差分析，两两间比较采用SNKq检验, P＜0.05为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1HER2/neu过表达以高表达HER2/neu的乳腺癌SKBr3作阳性对照，DAPI染细胞核，FITC二抗间接免疫荧光染色检测SPCA1细胞HER2/neu的表达. 免疫荧光显微镜下细胞核蓝染，肺腺癌细胞SPCA1绿色荧光强度与SKBr3的相近,表明SPCA1存在HER2/neu的过表达(图1). Western blot方法检测上述细胞HER2/neu蛋白，以肌动蛋白βactin做内参照，结果与免疫荧光法所得结论一致(图2).
　　图1FITC标记的HER2/neu间接免疫荧光染色×400（略）
　　1: SKBr3; 2: SPCA1.
　　图2HER2/neu蛋白表达的Western blot检测（略）
　　2.2载体构建与鉴定挑取重组质粒用EcoR I和Hind III双酶切鉴定和DNA序列分析，序列与预期完全相符，证明克隆构建正确. 将鉴定正确的重组质粒命名为pSUPERsiHER2，无关序列重组质粒为pSUPERnsRNA(图3).
1:DNA Marker DL 2000; 2:pSUPER; 3: pSUPERsiHER2.
　　图3重组质粒酶切鉴定（略）
2.3siRNA下调HER2/neu mRNA转录收集重组质粒pSUPERsiHER2瞬时转染SPCA1后72 h细胞，提取RNA进行RTPCR，以βactin作为内参照，检测HER2/neu的mRNA表达. 结果转染后的细胞HER2/neu mRNA表达显著下降，说明针对HER2/neu的siRNA在真核细胞中表达，可以显著抑制HER2/neu的mRNA表达(图4).
　　2.4siRNA下调HER2/neu蛋白表达收集pSUPERsiHER2瞬时转染SPCA1后72 h细胞，提取总蛋白，BAC法蛋白定量，上样量为40 μg/道，并以βactin作为内参照，Western blot结果显示, SPCA1的HER2/neu蛋白表达水平有下降，表明针对HER2/neu的siRNA可以抑制HER2/neu蛋白表达(图5).
　　M: DNA Maker DL2000; 1: 亲代SPCA1； 2: 转染pSUPERsiHER2 SPCA1； 3： 转染pSUPERnsRNA SPCA1； 4: 转染空载体pSUPER SPCA1.
　　图4HER2/neu mRNA表达的RTPCR检测（略）
　　1:亲代SPCA1；2：转染pSUPERsiHER2 SPCA1；3：转染pSUPERnsRNA SPCA1；4：转染空载体pSUPER SPCA1.
　　图5HER2/neu蛋白表达的Western blot检测（略）
　　2.5siRNA影响细胞周期收集pSUPERsiHER2瞬时转染72 h后的SPCA1，以亲代和转染pSUPER的细胞为对照，FCM检测细胞周期变化，结果转染pSUPERsiHER2的细胞G1期较亲代细胞增加9.9%、较转染pSUPER的细胞增加7.6%；S期细胞较亲代细胞减少8.6%、较转染pSUPER的细胞减少10.6%，G2M期变化不明显，表明siRNA主要阻抑细胞于G1期(图6).
　　A: 转染pSUPERsiHER2的SPCA1; B: 转染空载体pSUPER的SPCA1; C：亲代SPCA1.
　　图6FCM检测细胞周期分布（略）
　　2.6siRNA抑制细胞增殖收集重组质粒瞬时转染SPCA1细胞，连续5天检测细胞A值. 结果显示，转染重组质粒的SPCA1细胞生长速度较亲代细胞减慢(P<0.05)；转染无关序列和空载体质粒的细胞生长速度较亲代略有减慢(P>0.05)，表明针对HER2/neu的重组质粒转染SPCA1细胞，可有效抑制肿瘤细胞生长(图7).
　　3讨论
　　肺癌的发病率和死亡率已居恶性肿瘤首位. 晚期NSCLC治疗采取化疗为主的模式，然而2/3 NSCLC对化疗不敏感，晚期肺癌5 a生存率＜1%. HER2/neu在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织过表达,与肿瘤的发生、发展、转移、肿瘤血管形成及化疗耐药等有关,使其成为肿瘤靶向和基因治疗的理想靶点. 针对HER2/neu开展的乳腺癌等肿瘤治疗研究展示了良好前景［2,4,6］，然而应用HER2单抗Herceptin(trastuzumab)单独或联合化疗药物治疗NSCLC的几个Ⅱ期临床研究,未获得类似乳腺癌、前列腺癌那样的预期疗效,使研究者对HER2/neu是否在NSCLC的发生、发展中扮演重要角色产生怀疑［7-8］.
　　图7针对HER2/neu的siRNA抑制SPCA1细胞增殖（略）
　　基于转录后沉默效应(PTGS)的RNAi技术具有严格的序列特异性、高效性，基因抑制效果明确、治疗的针对性强、副作用小等优势，已日益发展成为研究基因功能和肿瘤基因治疗的重要工具［9-11］. 近年发展的DNA载体在体内表达siRNA的技术具有产生siRNA简便、快速、成本低廉等优点，极大地促进了RNAi技术在哺乳动物细胞中的应用［12-13］，这种载体可以是质粒、病毒或者DNA片段. 本研究使用pSUPER载体，全长3176 bp，其优势在于具有H1 III型聚合酶启动子，能够精确高效地转录出发夹状RNA，进而在体内被切割成可以发挥RNAi效应的siRNA，该系统已广泛用于基因表达调节的研究［14］.
　　我们将构建好的能够转录出发夹状siRNA的pSUPERsiHER2重组质粒转染过表达HER2/neu的SPCA1肺腺癌细胞， RTPCR和Western blot显示抑制了HER2/neu表达，证明针对HER2/neu的重组质粒转染SPCA1细胞后可以有效抑制HER2/neu表达,使靶细胞出现G0/G1期阻滞，造成细胞生长速度减慢，表明HER2分子参与了SPCA1细胞周期和增殖调控，在NSCLC的发展中具有重要作用，针对HER2/neu分子的siRNA可以用来治疗HER2/neu过表达NSCLC. 然而，瞬时转染存在基因沉默效应短暂、转染效率低等不足，还需要构建带筛选标记的siRNA表达质粒，进行稳定转染，以获得较长时间的基因沉默效应和更为理想的干涉效果.
　　【参考文献】
　　［1］ Tsai CM，Chang KT. Interrelationship between cellular nucleotide excision repair, cisplatin cytotoxicity and EGFR in NSCLC［J］．J Cancer Res，2000,91(2):213-222.
　　［2］ Atalay G, Cardoso F, Awada A，et al. Novel therapeutic strategies targeting the epidermal growth factor receptor (EGFR) family and its downstream effectors in breast cancer［J］. Ann Oncol, 2003,14(9):1346-1363.
［3］   Turken O, Kunter E, Cermik H, et al. Prevalence and prognostic value of cerbB2 expression in nonsmall cell lung cancer (NSCLC) ［J］. Neoplasma, 2003,50(4):257-261.
　　
　　［4］   PerezSoler R. HER1/EGFR targeting: Refining the strategy［J］. Oncologist，2004，9(1):58-67.
　　［5］   Ma J， Kahwaji CI, Ni Z, et al. Effects of simulated microgravity on arterial nitric oxide  synthese and nitrate and nitrite content［J］. J Appl Physiol，2003,94(1):83-92.
　　［6］   Zhao J, Zhang LH，Jia LT,et al．Secreted antibody/granzyme B fusion protein stimulates selective killing of HER2overexpressing tumor cells［J］．J Biol Chem，2004,279(20):21343-21348.
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　　［8］   Clamon G, Herndon J, Kern J, et al. Lack of trastuzumab activity in non small cell lung carcinoma with overexpression of erbB2: 39810: A phase II trial of Cancer and Leukemia Group B［J］．Cancer， 2005,103(8):1670-1675.
　　［9］   Milhavet O，Gary DS，Mattson MP．RNA interference in biology and medicine［J］．Pharmacol Rev，2003,55(4)：629-648.
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　　［13］  Sui GCH，Soohoo C，Afar EB，et al．A DNA vectorbased RNAi technology to suppres gene expresion in mammalian cells［J］．PNAS，2002,99：5515-5520.
　　［14］  Brummelkamp TR，Bemards R，Agami R，et al．A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells［J］. Science，2002,296：550-553.作者：任新玲，钱桂生，鲍炜，付海京，贾林涛，张瑞，王涛，许彦鸣，杨安钢
【关键词】  非小细胞肺
    Inhibition of tumor growth of nonsmall cell lung cancer by small interfering RNA targeting  to HER2/neu gene
　　【Abstract】 AIM: To construct RNA interference (RNAi) vector to downregulate HER2/neu gene and study the RNAi effect on the cell cycle and tumor growth of nonsmall cell lung cancer. METHODS: Oligonucleotides of 64 base pairs for hairpin RNA targeting HER2/neu were designed, chemically synthesized and annealed, and cloned into pSUPER vector．After identified by restriction digestion，the right vectors were transiently transfected into SPCA1 cells, a human lung adenocarcinoma cell line. The HER2 mRNA was detected by RTPCR, and the protein detected by  Western blot and indirect immunofluorescence staining. FCM analysis and MTT method were applied to measure cell cycle and cell growth respectively. RESULTS: SPCA1 cells had an overexpression of HER2. The vector of RNAi which can interfere HER2/neu gene was successfully constructed, and compared with parent cells, the vector can increase the number of cells in G0/G1 phase by 9.9%, and inhibit the tumor cell growth (P<0.05). CONCLUSION: We successfully constructed an expressing hairpin RNA against HER2/neu vector. The vector can effectively silence HER2/neu gene, increase the number of cells in G0/G1 phase, and then slow down the growth of tumor cells．This may be a useful therapeutic strategy for NSCLC overexpressing HER2/neu.
　　【Keywords】 siRNA; RNAi; carcinoma, nonsmallcell lung; HER2/neu
　　【摘要】 目的：构建针对HER2/neu的RNA干涉载体，观察对HER2/neu表达抑制及抑制后对非小细胞肺癌生长的影响. 方法：设计和合成长度为64nt的脱氧寡核苷酸链，退火互补成双链，克隆至pSUPER质粒载体，转化DH5α菌株，提取质粒，转染过表达HER2/neu的肺腺癌细胞系SPCA1，RTPCR检测HER2/neu的mRNA表达，Western blot和间接免疫荧光法检测HER2/neu的蛋白表达，FCM分析细胞周期变化，MTT法观察细胞生长. 结果：肺腺癌细胞系SPCA1存在HER2/neu过表达；成功构建了HER2/neu特异性RNA干涉载体pSUPERsiHER2；瞬时转染SPCA1细胞，HER2/neu的mRNA及蛋白表达均降低； G1期细胞较亲代增加9.9%；肿瘤细胞增殖速度减慢(P＜0.05). 结论：成功构建了HER2/neu RNA干涉载体，转染后可有效降低肺腺癌细胞系SPCA1 HER2/neu的mRNA转录及蛋白水平表达，阻滞转染细胞于G1期，造成转染细胞生长速度减慢，这有望为肺癌基因治疗提供一种选择手段.
　　【关键词】 siRNA；RNA干涉；癌,非小细胞肺；HER2/neu
　　0引言
　　
　　HER2/neu是由癌基因ErbB2/neu编码的具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜糖蛋白，分子量为185 ku, 属表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族，具有自动磷酸化作用. 乳腺癌、非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)等恶性肿瘤存在HER2/neu过表达，与肿瘤的发生、转移、血管形成及化疗耐药等有关［1-4］，本研究采用合成的编码针对HER2/neu siRNA的脱氧寡核苷酸模板序列，插入线性化pSUPER载体，把重组质粒转染过表达HER2/neu的肺腺癌细胞系SPCA1，观察转染后对HER2/neu mRNA转录和蛋白表达的抑制，及其对肺癌细胞周期及生长的影响.
　　1材料和方法
　　1．1材料pSUPER质粒和大肠杆菌DH5α菌种由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存；肺腺癌细胞系SPCA1由第四军医大学免疫学教研室保存； DNA Marker DL2000，LipofectamineTM 2000为Takara公司产品；细胞培养试剂、逆转录试剂盒、TRIZOL Reagent、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、ConcertTM Plasmid Midiprep System购自Gibco BRL公司；HER2/neu特异性单抗(小鼠抗人)购自neomarkers公司；FITC二抗(羊抗鼠)、辣根过氧化物酶（HRP）二抗(羊抗鼠，IgG)购自Transduction Laboratories公司.
　　1．2方法
　　1．2．1间接免疫荧光染色取制备好的过夜SPCA1细胞爬片，PBS洗涤，40 g/L多聚甲醛固定,3 g/L Triton100室温10 min，依此加入HER2一抗(含10 g/L BSA的PBS按1∶200稀释)4℃过夜， FITC二抗(1∶200稀释)室温1 h，DAPI室温3 min，荧光显微镜观察并照相.
　　1．2．2序列设计在NCBI数据库中查找人HER2/neu的mRNA全序列，提交发夹状RNA设计网站选择最佳干涉位点，本研究选取的靶位点是：547～566. 针对靶位点设计脱氧寡核苷酸序列如下：oligo1: 5′ gatcccctgatagacaccaaccgctcttcaagagagagcggttggtgtctatcatt
tttggaaa 3′；oligo2：是针对来源于深海水母的绿色荧光蛋白的一段序列，与人无同源性，做为无关序列对照(序列略)，由上海生工生物工程技术服务公司合成.
　　1．2．3脱氧寡核苷酸与pSUPER的连接与转化将合成的脱氧寡核苷酸序列退火、磷酸化成双链DNA； BglⅡ和Hind III双酶切pSUPER；连接酶连接pSUPER和磷酸化产物,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，铺于带有氨苄青霉素抗性的培养皿，37℃过夜，挑取重组质粒进行双酶切和DNA序列分析鉴定.
　　1．2．4细胞培养和质粒转染SPCA1细胞常规培养于含100 g/L FBS的RPMI 1640液，常规加：5×107 U／L青霉素，50 g／L链霉素. 取对数生长期贴壁细胞,使用LipofectamineTM 2000进行基因转染，按照说明书进行操作.
　　1．2．5RTPCR收集转染后72 h SPCA1细胞，Trizol reagent提取总RNA，用SuperScriptTM First Strand System for RTPCR试剂盒反转录，按照说明书进行操作. 以cDNA为模板对HER2/neu进行PCR扩增，扩增片断位于181~606 bp，按天为时代公司的一管便携式PCR试剂盒说明操作. 使用PCR上游引物P1:5′ ctgtttgccgtgccaccctgagt 3′, 下游引物P2: 5′ cttctgctgccgtcgcttgatgag 3′. 反应条件：95℃ 30 s变性，56℃ 20 s退火，72℃ 30 s延伸，30个循环. 10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物.
　　1．2．6Western blot收集转染后72 h SPCA1细胞，用含RIPA的裂解液提取总蛋白，BCA法蛋白定量，上样量40 μg/道，80 g/L SDSPAGE电泳，转移至NC膜，50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h，依次加入特异性HER2一抗(1∶800稀释) 4℃过夜，HRP二抗室温孵育1 h，增强化学发光法检测HER2/neu表达［5］.
　　1．2．7FCM检测细胞周期用10 g/L FBS培养细胞，收集转染后72 h SPCA1细胞，制成1×109/L单细胞悬液，PBS洗涤后注入750 mL/L的4℃乙醇固定，用含RNA裂解酶的PI对样品DNA荧光染色15 min，流式细胞仪(FCM)检测细胞周期.
　　1．2．8MTT法检测细胞增殖取对数生长期细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至2×107/L，按4×103/孔接种于96孔培养板，终体积200 μL/孔，100 g/L FBS培养细胞，分别于转染后24, 48, 72, 96和120 h加入20 μL MTT(5 g/L)/孔，4 h弃上清，加DMSO 150 μL 20 min，振荡15 min，在ELISA读数仪490 nm波长处测各孔吸光值(A). 每组设5个复孔，实验重复3次，绘制细胞增殖曲线.
　　统计学处理： 计量资料以x±s表示，组间比较采用SPSS软件包进行方差分析，两两间比较采用SNKq检验, P＜0.05为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1HER2/neu过表达以高表达HER2/neu的乳腺癌SKBr3作阳性对照，DAPI染细胞核，FITC二抗间接免疫荧光染色检测SPCA1细胞HER2/neu的表达. 免疫荧光显微镜下细胞核蓝染，肺腺癌细胞SPCA1绿色荧光强度与SKBr3的相近,表明SPCA1存在HER2/neu的过表达(图1). Western blot方法检测上述细胞HER2/neu蛋白，以肌动蛋白βactin做内参照，结果与免疫荧光法所得结论一致(图2).
　　图1FITC标记的HER2/neu间接免疫荧光染色×400（略）
　　1: SKBr3; 2: SPCA1.
　　图2HER2/neu蛋白表达的Western blot检测（略）
　　2.2载体构建与鉴定挑取重组质粒用EcoR I和Hind III双酶切鉴定和DNA序列分析，序列与预期完全相符，证明克隆构建正确. 将鉴定正确的重组质粒命名为pSUPERsiHER2，无关序列重组质粒为pSUPERnsRNA(图3).
1:DNA Marker DL 2000; 2:pSUPER; 3: pSUPERsiHER2.
　　图3重组质粒酶切鉴定（略）
　　2.3siRNA下调HER2/neu mRNA转录收集重组质粒pSUPERsiHER2瞬时转染SPCA1后72 h细胞，提取RNA进行RTPCR，以βactin作为内参照，检测HER2/neu的mRNA表达. 结果转染后的细胞HER2/neu mRNA表达显著下降，说明针对HER2/neu的siRNA在真核细胞中表达，可以显著抑制HER2/neu的mRNA表达(图4).
　　2.4siRNA下调HER2/neu蛋白表达收集pSUPERsiHER2瞬时转染SPCA1后72 h细胞，提取总蛋白，BAC法蛋白定量，上样量为40 μg/道，并以βactin作为内参照，Western blot结果显示, SPCA1的HER2/neu蛋白表达水平有下降，表明针对HER2/neu的siRNA可以抑制HER2/neu蛋白表达(图5).
　　M: DNA Maker DL2000; 1: 亲代SPCA1； 2: 转染pSUPERsiHER2 SPCA1； 3： 转染pSUPERnsRNA SPCA1； 4: 转染空载体pSUPER SPCA1.
　　图4HER2/neu mRNA表达的RTPCR检测（略）
　　1:亲代SPCA1；2：转染pSUPERsiHER2 SPCA1；3：转染pSUPERnsRNA SPCA1；4：转染空载体pSUPER SPCA1.
　　图5HER2/neu蛋白表达的Western blot检测（略）
　　2.5siRNA影响细胞周期收集pSUPERsiHER2瞬时转染72 h后的SPCA1，以亲代和转染pSUPER的细胞为对照，FCM检测细胞周期变化，结果转染pSUPERsiHER2的细胞G1期较亲代细胞增加9.9%、较转染pSUPER的细胞增加7.6%；S期细胞较亲代细胞减少8.6%、较转染pSUPER的细胞减少10.6%，G2M期变化不明显，表明siRNA主要阻抑细胞于G1期(图6).
　　A: 转染pSUPERsiHER2的SPCA1; B: 转染空载体pSUPER的SPCA1; C：亲代SPCA1.
　　图6FCM检测细胞周期分布（略）
　　2.6siRNA抑制细胞增殖收集重组质粒瞬时转染SPCA1细胞，连续5天检测细胞A值. 结果显示，转染重组质粒的SPCA1细胞生长速度较亲代细胞减慢(P<0.05)；转染无关序列和空载体质粒的细胞生长速度较亲代略有减慢(P>0.05)，表明针对HER2/neu的重组质粒转染SPCA1细胞，可有效抑制肿瘤细胞生长(图7).
　　3讨论
　　肺癌的发病率和死亡率已居恶性肿瘤首位. 晚期NSCLC治疗采取化疗为主的模式，然而2/3 NSCLC对化疗不敏感，晚期肺癌5 a生存率＜1%. HER2/neu在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织过表达,与肿瘤的发生、发展、转移、肿瘤血管形成及化疗耐药等有关,使其成为肿瘤靶向和基因治疗的理想靶点. 针对HER2/neu开展的乳腺癌等肿瘤治疗研究展示了良好前景［2,4,6］，然而应用HER2单抗Herceptin(trastuzumab)单独或联合化疗药物治疗NSCLC的几个Ⅱ期临床研究,未获得类似乳腺癌、前列腺癌那样的预期疗效,使研究者对HER2/neu是否在NSCLC的发生、发展中扮演重要角色产生怀疑［7-8］.
　　图7针对HER2/neu的siRNA抑制SPCA1细胞增殖（略）
　　基于转录后沉默效应(PTGS)的RNAi技术具有严格的序列特异性、高效性，基因抑制效果明确、治疗的针对性强、副作用小等优势，已日益发展成为研究基因功能和肿瘤基因治疗的重要工具［9-11］. 近年发展的DNA载体在体内表达siRNA的技术具有产生siRNA简便、快速、成本低廉等优点，极大地促进了RNAi技术在哺乳动物细胞中的应用［12-13］，这种载体可以是质粒、病毒或者DNA片段. 本研究使用pSUPER载体，全长3176 bp，其优势在于具有H1 III型聚合酶启动子，能够精确高效地转录出发夹状RNA，进而在体内被切割成可以发挥RNAi效应的siRNA，该系统已广泛用于基因表达调节的研究［14］.
　　我们将构建好的能够转录出发夹状siRNA的pSUPERsiHER2重组质粒转染过表达HER2/neu的SPCA1肺腺癌细胞， RTPCR和Western blot显示抑制了HER2/neu表达，证明针对HER2/neu的重组质粒转染SPCA1细胞后可以有效抑制HER2/neu表达,使靶细胞出现G0/G1期阻滞，造成细胞生长速度减慢，表明HER2分子参与了SPCA1细胞周期和增殖调控，在NSCLC的发展中具有重要作用，针对HER2/neu分子的siRNA可以用来治疗HER2/neu过表达NSCLC. 然而，瞬时转染存在基因沉默效应短暂、转染效率低等不足，还需要构建带筛选标记的siRNA表达质粒，进行稳定转染，以获得较长时间的基因沉默效应和更为理想的干涉效果.
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