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兔VX2肿瘤的离体培养及有关生物学特性           ★★★ 【字体：小 大】
兔VX2肿瘤的离体培养及有关生物学特性
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-9-30    
作者：苏畅，张惠中，李文海，林芳，梁晓华，江吕泉，程庆书
【关键词】  肿瘤细胞
    Culture in vitro and related biological characteristics of rabbit VX2 carcinoma cells
　　【Abstract】 AIM: To separate and purify the rabbit VX2 carcinoma cell line in vitro and to characterize its biological features. METHODS: VX2 tumor fragments were isolated and cultured with explant culture techniques and enzymatic digestion in vitro. After 40 passages, the cell morphology, cell cycle, karyotype and tumorigenecity in rabbits and nude mice were investigated. RESULTS: The newly established cell line VX2 was maintained in continuous culture over 50 passages for 8 months. Morphologically, VX2 cells were uniform, round and polygonal epithelial cells. The cells were small but had a high nucleocytoplasmic ratio. The cell cycle analysis showed 74.61% in G1 phase, 7.78% in G2 phase and 17.6% in S phase. The population doubling time was 26.4 h. The chromosomal analysis showed a hypotriploid with a median chromosome number of 60. The tumorigenecity in rabbits and nude mice will be ensured under a high VX2 cell inoculating concentration. CONCLUSION: The VX2 is a squamouscell carcinoma resulting from malignant change in a papilloma induced with the Shope virus in rabbits. It has already been purified in vitro, and can be applied to further researches.
　　【Keywords】 rabbits; tumor cells, cultured; tumor markers, biology
　　【摘要】 目的：在体外分离纯化VX2肿瘤细胞，观察其生物学特性. 方法：采用组织块法和消化法结合对兔VX2肿瘤进行原代培养,体外传代观察,传代40次并对培养细胞进行形态 学观察、细胞周期检查、核型分析、兔及裸鼠移植. 结果：纯化的兔VX2肿瘤细胞形态一致，呈圆形、多角形的上皮细胞,体积小,核浆比倒置,体外连续培养8 mo,传代50次以上,细胞倍增时间为26.4 h,细胞周期测定G1期为74.61%, G2期为7.78%, S期为17.6%. 染色体为亚三倍体核型,众数为60条. 高细胞浓度可保证同种移植成瘤率,裸鼠移植可成瘤, 无支原体污染. 结论：兔VX2肿瘤细胞系来源于Shope病毒致乳头瘤恶变形成的鳞状上皮细胞恶性肿瘤,目前已经纯化，可应用于进一步肿瘤实验研究.
　　【关键词】 兔; 肿瘤细胞,培养的; 肿瘤标记,生物学
　　0引言
　　兔VX2肿瘤是来源于Shope病毒致乳头瘤恶变形成的上皮细胞恶性肿瘤，属于鳞状细胞癌，1940年建株［1］，国内文献对其来源描述不统一. 其特点可接种在兔体内，具有较高的肺、肝转移特性，在大型动物模型的研究上具有很高的应用价值. 国际上一直没有建成受到公认并广泛使用的VX2细胞系，多数仍以组织块方法保存. 为进一步进行离体研究，我们分离并纯化了VX2瘤株，并进行了生物学特性观察.
　　1材料和方法
　　1.1材料新西兰大白兔9只和BALB/c裸鼠均购自第四军医大学实验动物中心；原代培养所用肿瘤组织来源于本院液氮保存冰冻组织块，于新西兰大白兔腿部肌肉内接种并增殖. 胎牛血清（FBS, Gibco）；培养瓶（Costar）；RPMI 1640（Gibco）；24孔板(Nunc, Roskilde, Denmark)；广谱抗细胞角蛋白(PCK)混合型鼠抗兔mAb（Boster），广谱抗细胞波形蛋白鼠抗猪mAb（福州迈新公司）；秋水仙素（西安山川公司）离心机（LD52A，北京医用离心机厂）；其他试剂及仪器取自唐都医院中心实验室.
　　1.2方法
　　1.2.1肿瘤细胞的分离纯化无菌摘取VX2肿瘤边缘增殖活跃部分,用PBS液冲洗3次,在显微镜下剔除多余组织，剪成直径0.5～1.0 mm左右的小块,以2.5 g/L胰酶加1 g/L胶原酶于37℃消化20 min，200目尼龙网过滤后800 r/min离心5 min，取沉淀物培养，较低密度接种于6孔板. 组织块贴壁接种于预先涂抹薄层FBS的培养瓶（Costar）瓶底，瓶底朝上，向瓶内加入含100 mL/L FBS和青链霉素双抗的RPMI 1640培养液5 mL，置37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度的培养箱内, 2 h后缓慢将培养瓶翻转. 消化法第2日即见细胞生长. 组织块法于第3日组织块均浮起，可见细胞生长. 于岛状生长的细胞处在倒置显微镜下无菌刮取，培养，取得多瓶纯化细胞，其形态、生长速度基本一致. 待细胞成片生长、占据大部分瓶底时即用2.5 g/L胰蛋白酶于37℃下消化传代.
　　1.2.2形态学观察分别取纯化后第10代和50代的细胞进行细胞爬片、HE染色、倒置显微镜镜下观察. 将VX2瘤接种于兔腿部肌肉，待成瘤后切片光镜下观察.
　　1.2.3生长特性测定将第50代细胞以1×107/L的密度接种于24孔板，每孔加入含100 mL/L FBS的1640培养基0.5 mL，置细胞培养箱中培养. 每日同一时间用胰蛋白酶消化3孔细胞，血球计数板进行计数，连续进行4 d，绘制细胞生长曲线. 利用SPSS软件指数函数拟合模型(Exponential)辅助计算细胞群体倍增时间［2］. 制作细胞爬片，分别于贴壁后24，48，72 h计算分裂指数.
　　1.2.4琼脂集落形成率测定收集第52代细胞和相应的对照细胞，制备含细胞的3.5 g/L琼脂糖液，并加到7 g/L琼脂糖凝胶上，于37℃，50 mL/L CO2、饱和湿度条件下培养. 3 wk后计算集落形成率.
　　1.2.5免疫细胞化学分析取第55代细胞爬片，室温下用1∶1混合的甲醇与丙酮将生长在盖玻片上的细胞固定15～20 min，分别应用PCK混合型鼠抗兔mAb及超敏加广谱抗细胞波形蛋白鼠抗猪mAb行免疫组织化学染色，光学显微镜下观察.
　　1.2.6染色体分析取处于80%汇合时的第60代细胞加入终浓度为0.3 mg/L的秋水仙素，在37℃，50 mL/L CO2、饱和湿度的培养箱中孵育5 h, 然后尽量吹打使阻断于分裂中期的细胞脱壁，将细胞悬液装入10 mL离心管. 1100 r/min离心10 min，去上清液，再向离心管中轻轻加入6 mL低渗盐溶液75 mmol/L KCl，37℃静置30 min. 然后加入2 mL新鲜固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）预固定，用移液管吹打调匀. 1100 r/min离心10 min，去上清液. 之后加入新鲜固定液8 mL，轻轻吹打均匀，离心10 min；本步骤再重复2遍. 末次离心后，小心吸除大部分上清液，余下0.5～1.0 mL固定液，轻轻吹打调匀. 吸少量细胞悬液，滴落在-20℃预冷过的洁净载玻片上,迅速在酒精灯火焰上烤干. 制备好的玻片立即用Giemsa染色. 显微镜下观察染色后的标本，统计其染色体数目.
　　1.2.7细胞周期测定用2.5 g/L胰蛋白酶加0.25 g/L EDTA消化培养细胞，确保细胞尽可能打散，PRM 1640重悬后移至1.5 mL离心管中， PBS离心清洗3遍后，加入DPBS（Dulbeccos phosphate buffered saline）配制的750 mL/L冰乙醇，4℃固定2 h或过夜，PBS再离心清洗1遍后用1 g/L RNase 37℃消化20～30 min，DPBS离心清洗2遍，300目尼龙网过滤，0.2～0.3 mL DPBS重悬，PI染色5 min后流式细胞仪测定细胞周期.
　　1.2.8同种异体移植取第60～70代的对数生长期细胞，将新西兰兔分为3组，每组3只，分别以1×109，1×1010，1×1011个/L的细胞悬液4 mL接种于兔腿部肌肉，观察肿瘤在肌肉内的生长情况.
　　1.2.9裸鼠移植取第60～70代对数生长期细胞2×1011个/L,接种于3只BALB/c裸鼠腋窝皮下, 每只1 mL，观察肿瘤在肌肉内的生长情况.
　　1.2.10支原体及致高钙血症能力检测采用地依红染色及肉汤培养法检测培养液及细胞内支原体. 对成功接种VX2瘤的兔子进行耳缘静脉采血，检测血清钙离子浓度［3-4］.
　　1.2.11细胞系的维持、冻存与复苏取对数生长期细胞，用DHanks液漂洗3遍，2.5 g/L胰蛋白酶加0.2 g/L EDTA消化细胞5 min，收集细胞， 800 r/min离心5 min，用1640培养液重悬细胞，每瓶细胞分种3～5瓶，同时冻存适量细胞，冻存液为培养液中加入100 mL/L血清及80 g/L二甲基亚砜，放入液氮罐中保存. 将盛有VX2细胞的冷冻管（已冷冻保存1 mo）从液氮中取出，37℃水浴，使细胞迅速融化，将细胞悬液移入预温至37℃、含有100 mL/L血清的1640培养液中，置于37℃，50 mL/L CO2及饱和湿度的培养箱中培养，细胞的成活率大于80%.
　　2结果
　　2.1细胞形态最初纯化的细胞部分在相差显微镜下可见扇形细胞质（fanlike membranes）（图1）,经过一段时间传代，细胞呈上皮样细胞排列, 单层贴壁生长,有铺路石征，生长成团后即出现重叠生长现象，细胞以多边形为主（图2）. HE染色见细胞轻度嗜碱,核大,核质比例异常, 细胞呈异型性明显，可见较多核分裂象(图3).
　　2.2生长特性细胞生长于第3日达到高峰. 细胞倍增时间为26.4 h. 第55代细胞的生长曲线见图4，细胞分裂指数分别为：24 h，1.9%；48 h，7.0%；72 h，9.3%. 双层琼脂形成率为22.1%.
　　图1倒置显微镜下兔VX2肿瘤细胞呈扇形细胞质×400（略）
　　图2传代后倒置显微镜下兔VX2肿瘤细胞呈多边形为主×100（略）
　　图3兔VX2肿瘤细胞形态 ×100（略）
　　2.3免疫组织化学染色细胞胞质中可见到PCK免疫组织化学染色弱阳性，波纹蛋白染色阴性.
2.4染色体分析在100个分裂中期细胞中，染色体数目主要分布于57～62之间，染色体众数为60，多为亚三倍体. 染色体有缺失、断裂、易位等结构异常.
　　2.5细胞周期分析流式细胞仪分析结果显示G0/G1：74.61%； G2/M：7.78%； S：17.6%； G2/G1：1.87；DI：2.40.
　　图4第55代细胞的生长曲线（略）
　　2.6同种异体移植及裸鼠移植以1×109个/L细胞密度接种的3只兔子均未成瘤；以1×1010个/L接种的有2只成瘤，其中1只于3 wk后停止生长，解剖后可见瘤体基本为豆渣样坏死；以1×1011个/接种的有2只成瘤. 3只成功成瘤的兔子成瘤潜伏期约10 d，分别于36，38，45 d后衰竭死亡. 解剖后可见瘤体无包膜，呈侵润性生长，中心豆渣样坏死，多有大量脓血，广泛转移，与传统组织块接种法成瘤特点一致. 3只裸鼠均成瘤（图5）.
　　图5兔VX2细胞裸鼠移植，可见后肢皮下有成瘤现象（略）
　　2.7支原体及致高钙血症能力检测支原体检测阴性. 动物在接种后1 wk化验血钙波动在2.1～2.5 mmol/L之间.
　　3讨论
　　兔VX2肿瘤是世界上广泛使用、可在大型动物体内生长的恶性肿瘤，常用于恶性肿瘤介入和射频治疗的研究［3-5］及影像学研究和动物模型的建立［6-7］，其优越性是小型实验动物肿瘤模型所无法比拟的. 国内经常采用部位命名法来命名VX2肿瘤，如兔VX2肝癌，却忽视了VX2瘤是乳头瘤恶变而成的上皮来源的恶性肿瘤. 国外对于体外VX2细胞系的建立一直有争议，Osato等最早与1967年体外培养的VX2细胞由于培养箱故障而丢失［8］，Voelkel等［9］建立了一株VX2细胞系，活力成瘤能力低，并且丧失了产生PGE2的能力，没有受到公认. 1982年Easty等［10］建立了VX2细胞系，与此同时瑞士的Rolf等也建立了该细胞株，并与之有差异，而比较结果没有报道，细胞系也没有广泛应用. 1985年Georges等［11］发现了2种不同的VX2瘤株，一种VX2R高表达角蛋白，仅能在裸鼠体内成瘤，另一种VX2R低表达角蛋白，成瘤能力强. Dabbous等［12］1980年也曾发现3种形态不同的VX2细胞. 刘险峰等［13］纯化了一株高表达角蛋白，高成瘤能力的VX2瘤株. 本实验纯化的VX2瘤株形态学上与文献［8,10,11］的报道结果相似，致高钙血症能力检测，与Doppelt等［14-15］的结果相同，从角蛋白表达低、接种后兔存活期短来看，恶性程度比较高，但是成瘤能力较国内一些研究较弱. 我们还发现接种后有个别肿瘤自发性衰退的现象，与Osato等报道的VX7瘤自发性衰退相似. 结合本实验和国外的文献报道，考虑VX2自身可能发生一定程度的分化，这可能与VX2瘤在国内外多以冰冻组织块法保存有关，发生自发性衰退和恶性程度减低的细胞必然在传代的过程中淘汰，因此怀疑VX2的恶性程度略有增高的可能性大，但是VX2肿瘤的基本性质没有变化，仍然是一株具有很高实用价值的应用与大型实验动物的肿瘤细胞. 1988年VX2瘤株从日本传入我校以来，一直主要以液氮冷冻组织块和动物体内传代结合的方法保存，为进行进一步体外研究，我们纯化了该细胞系，经过长时间传代，性质稳定，可用于体外实验. 实验中发现的低细胞数量下成瘤能力下降和自发性消退现象，其原因尚需进一步研究.
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