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| 两套袖法大鼠原位肝移植模型的建立及改进 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-9-30  |
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【关键词】 原位肝移植 Establishment and improvement of rat orthotopic liver transplantation model with twocuff technique 【Abstract】 AIM: To improve the model of rat orthotopic liver transplantation and study the rates of success and longterm survival of the model. METHODS: On the basis of twocuff technique of Kamada, weve improved the techniques of separating, perfusing donor liver, the shearing and anastomosis of the superior and inferior caval veins, the bile duct anastomosis, and so on. RESULTS: Operation had been performed 80 times with improved techniques and 92 times with conventional techniques. In contrast to conventional techniques, the improved techniques reduced the average time of donor operation and that of recipients to （24.3±3.2） min and (56.4±5.0) min（P<0.05）, elevated 48hour survival rate to 91.3%(73/80) and 1week survival rate to 87.5%(70/80)（P<0.05）. CONCLUSION: The improved techniques have raised the quality of donor liver and the success rate of the model. 【Keywords】 orthotopic liver transplantation; rat; model; improvement 【摘要】 目的: 改进两套袖法大鼠原位肝移植模型，研究其手术成功率和远期存活率. 方法：在Kamada两套袖法基础上,着重对供肝分离、灌注、肝上下腔静脉切取，肝上下腔静脉吻合，胆管吻合等手术方法作了进一步改进. 结果：改进方法共施行手术80次，与以往92次传统手术法相比，供体手术时间（24.3±3.2）min和受体手术时间(56.4±5.0) min缩短（P<0.05），48 h存活率91.3% (73/80)和1 wk存活率87.5% (70/80)明显提高（P<0.05）. 结论：改进的两套袖法大鼠原位肝移植能明显提高供肝的质量和受体手术成功率. 【关键词】 原位肝移植；大鼠；模型；改进 0引言 大鼠原位肝移植是肝移植基础研究的理想模型. 1973年，Lee等首次提出 “缝合法”大鼠原位肝移植［1］，此后，二套袖法(门脉、肝下下腔静脉套袖吻合)、三套袖法(门脉、肝上下腔静脉、肝下下腔静脉均用套袖吻合) 及各种改良方法相继出现［2-4］. 目前，二套袖法因成功率高已成为主要建模方法,但由于操作复杂，影响成功的因素多，故而难以推广应用. 我们在传统二套袖法基础上进行改进, 成功建立了模型，降低了其制作难度，并提高了手术成功率. 1材料和方法 1.1材料雄性SD大鼠160只,体质量200～250 g(购于第四军医大学实验动物中心) , 受体体质量略重于供体（30 g左右），供、受体术前12 h禁食. 自制聚乙烯袖套:门脉袖套内径1.8～2.0 mm,肝下下腔静脉袖套内径2.5～3.0 mm，胆管插管由硬膜外麻醉管制成，长0.4～0.5 mm. 双极电凝器, 上海手术器械厂显微外科手术器械包,乙醚麻醉筒，清洁手术. 1.2方法 1.2.1供体手术术前肌注阿托品0.03～0.05 mg，乙醚吸入麻醉，仰卧位,背部垫1 mL注射器作为腰桥. 取上腹部大十字切口，上至剑突，下至耻骨联合，左右至腋后线. 进腹后, 暂不分离肝脏. 将肠管推向左下腹，暴露第一肝门及肝下下腔静脉. 将尾状叶推向左侧，显露右肾上腺，电灼切断肾上腺静脉. 分离右肾静脉与肝下下腔静脉. 结扎切断右肾蒂，下腔静脉游离完成. 游离胆管，尽量保留周围组织，以防术后缺血坏死，在肝管汇合部远端0.5 cm处剪开胆总管前壁,向近端插入支撑管,丝线结扎并保留. 插管前可用显微镊轻扩胆管，注意插入不要过深，以防堵塞盘状乳头叶胆管. 于下腔静脉远端注射2 mL肝素生理盐水(25 U/mL)全身肝素化. 结扎切断幽门静脉，在门脉左侧结扎肝固有动脉. 阻断肠系膜上静脉远端，近端插入自制灌注管，立即用0～4℃肝素生理盐水(5 U/mL)经输液器匀速灌注. 剪开下腔静脉远端及肝上下腔静脉胸段，使灌注液顺利流出，同时向肝脏淋撒0～4℃生理盐水降温. 待肝脏变成土黄色后，剪断肝下下腔静脉、门静脉，残端尽量留长. 由下向上剪断肝周韧带，直至肝上下腔静脉. 靠肝脏缝扎膈肌静脉，略微分离肝上下腔静脉后方组织，轻轻下牵肝脏，“一剪法”剪下肝上下腔静脉，使其不带隔肌组织. 1.2.2供肝修整供肝置于0～4℃生理盐水中. 选取口径合适套管，管柄统一置于血管前壁用以定位，将门静脉牵入套管中，血管夹固定套管和血管，夹柄部固定. 外翻血管套在袖套上，丝线固定. 操作中注意避免血管扭转. 同法处理肝下下腔静脉. 肝上下腔静脉无需修整,在其左右侧角各缝吊80缝线,备吻合时用. 修整完毕后置4℃冰箱中保存. 1.2.3受体手术术前处置同供体. 取上腹部弧形切口，电灼切开肌肉. 剪断肝周韧带, 缝扎左膈静脉，电灼离断肝食管间血管及右肾上腺静脉,适当分离肝下下腔静脉至右肾静脉汇入处. 于胆管汇合处上方切断肝管，将左肝管于汇入处斜行剪除. 切断肝动脉. 分离门脉至幽门静脉处. 阻断肝下下腔、门静脉. 于门脉左右分支处穿刺,推平衡盐2 mL驱血,至肝脏变为土黄色. 用自制血管夹连带部分膈肌阻断肝上下腔静脉. 下牵肝脏,剪断肝上下腔,保留足够长度残端. 剪断门脉时保留左右分支，肝下下腔残端保留部分肝组织. 取出肝脏，撤除麻醉，原位放入供肝,肝前、后放湿沙布. 将肝上下腔两侧吊线与受体静脉左右两端内进外出缝合打结，然后从左至右连续外翻缝合肝上下腔后壁,至右侧角打结，同理缝合静脉前壁. 显露第一肝门，于受体门脉左右分支缝牵引线，向头侧牵开，于分支汇合处剪开其前壁，松血管夹排除少量血液，供肝门脉套入受体门脉中,丝线固定,套入同时冲洗吻合口. 开放门脉,肝上下腔静脉,结束无肝期. 温生理盐水腹腔复温. 此时肝脏迅速充血，肠管淤血减轻,数分钟即可见胆汁流出. 若有局部灌注不良区可通过按摩手段改善. 同法完成肝下下腔吻合. 用1∶5～7的碳酸氢钠和乳酸林格液2 mL在肝下下腔和左肾静脉分叉平面下方注入补液，可以稀释血液并对抗无肝期造成的酸中毒，还可以增加血容量［5］. 冲洗胆管支撑管及受体胆管，供肝胆管结扎线向下牵引固定后，支撑管套入受体胆管中，供受体胆管结扎线拉拢打结. 大网膜覆盖胆管吻合处. 冲洗腹腔,全层连续缝合腹壁切口. 术后光照6 h保暖，定期皮下补充平衡盐. 24 h后可随意进食. 统计学处理：采用SPSS 10.0统计软件分析数据，各组资料数据用x±s表示,均数间比较采用u检验,存活率间采用χ2检验.P<0.05表示差异有显著性. 图1“一剪法”供肝切取示意图（略） 图2改进的胆管修剪法示意图（略） 2结果 按照以上改进方法共行80次手术. 供体手术时间(24.3±3.2)min，受体手术需(56.4±5.0)min，供肝热缺血0 min,冷缺血(61.0±4.3) min，修肝需(8.2±2.1) min,安装袖套(6.2±1.0) min. 肝上下腔静脉吻合(12.1±3.2)min,门脉和肝下下腔静脉吻合各需(4.3±1.0)min, 无肝期(19.4±3.1)min,胆管吻合(3.2±1.0)min. 48 h存活率91.3%(73/80),1 wk存活率87.5%(70/80). 术后48 h内死亡为手术失败, 共计7例. 肝上下腔吻合口出血3例, 门脉袖套脱落出血及血栓各1例, 胆道支撑管脱出1例, 肺栓塞1例. 术后第3天肺部感染死亡1例, 第5日胆管坏死、胆漏2例. 其余均存活1 wk以上. 以往采用Kamada传统方法共行92次手术，供体手术(36.3±4.2) min，受体手术(75.4±5.3)min，48 h存活率78.3%（72/92）,1 wk存活率73.9%（68/92）. 两组供、受体手术时间及存活率间差异显著(P<0.05). 3讨论 本实验通过改进原有方法，明显提高了模型成功率，总结如下：①采用类似人肝移植手术切口，供体采用上腹部大十字切口，受体采用上腹部弧形切口. 术野显露充分，无需腹壁牵开器，能很好的满足手术需要. ②大鼠肝脏质地娇嫩，过多翻动亦可引起损伤. 提高供肝质量关键之一在于减少术中翻动. 目前切肝时多先游离肝周组织，然后灌注. 我们在取肝时先不游离，肝脏保持原位灌洗. 切肝时利用下腔静脉远端和胆管结扎线作牵引，不触及肝脏，由下向上锐性剪取，因而减小了损伤机会，供肝质量明显提高. ③直接、简便快速的灌洗是获得良好供肝的重要保证. 我们采用门脉灌洗法. 经肝下下腔远端行全身肝素化，为减少热缺血时间，幽门静脉、脾静脉及肝动脉待灌洗前再结扎，同时用冰盐水使肝脏迅速降温. 灌注管用小儿头皮针塑料管，前端剪成斜面制成，经输液器匀速灌注，液面高度距操作台40 cm,灌注速度约40～50滴/min（<3 mL/min），共约10～20 mL盐水. 目前亦有学者采用经腹主动脉灌注，认为可起到双重灌注效果［6］. 我们也试用过该法，但因操作较复杂，明显增加热缺血时间，供肝质量未见明显改善. ④传统供肝切取均保留隔肌，待后修整. 我们处理肝上下腔时略微分离其后组织，轻轻下牵肝脏，眼科剪紧贴隔肌“一剪法”剪下肝上下腔，使其不带隔肌环(图1). 此法切取后肝上下腔可保留足够长度，残端整齐，吻合口有足够大小，无需修整，明显缩短了修肝及冷缺血时间，同时也保证了高质量的吻合. ⑤供肝修整. 修肝的关键在于避免血管扭曲. 静脉周围组织应尽量剥干净，以防上套管后管腔狭窄. 根据右肾静脉、幽门静脉结扎线位置辩明血管方向. 套管柄统一置于血管前方定位. 上完套管后向其内推少量盐水，血管应充盈良好，无扭曲等. ⑥受体自身输血. 大鼠血容量少，出血总量超过2～3 mL者术后极难存活. 为避免切肝后回心血量骤减，阻断肝上下腔静脉前，在门静脉左右分支处穿刺推注平衡盐液2 mL，可驱使1～2 mL肝内血液进入体循环，类似于自体血液回输，可补充血容量，增加手术耐受性，利于防止血栓形成. ⑦肝上下腔吻合是受体存活的关键，决定了无肝期的长短. 无肝期超过26 min则难以存活. 高质量吻合的前提在于充分的术野显露. 大鼠膈下空间小而深，不利显露. 我们用注射器作为腰桥，使其背部弓起，肝下垫纱布，稍向下牵，同时通过调整肝上阻断钳位置来保证静脉端的对合. 采取不保留隔肌环连续外翻法吻合静脉前后壁，边距约1 mm，针距约2 mm，针脚均匀，保证静脉内膜光整. 左右侧角是术后出血的常见部位，应多缝几针加强. 本实验术后出血率仅为3.75％. 有学者也采用带膈肌环的静脉吻合［7］，但缝合时进出针困难，吻合后内膜欠光整，狭窄、阻塞等发生较多. ⑧门脉及肝下下腔吻合. 注意静脉吻合口的准备，受体门脉应保留左右分支，肝下下腔应保留少量肝组织（静脉口可自动张开），吻合时辨清方向，先将静脉左右角缝线牵引，向头侧牵开固定，松血管夹排除少量血液及血栓，然后牵开其前壁，夹住套管柄套入，同时淋撒肝素生理盐水，以防气泡进入. ⑨胆道重建. 大鼠胆管细，吻合难度大. 传统法吻合口位于胆总管处，位置低，开口小，术后插管易脱出. 我们在供肝切取时于供体左肝管汇入处斜行剪开，在此进行吻合，提高了吻合口的位置，且扩大了胆管开口，提高了吻合速度及成功率，避免了反复插管对胆道的损伤(图2). 吻合完成后，可按Tanaka等［8］的方法，将胆管支架管用大网膜覆盖后再固定在门脉袖套上，可避免术后胆总管滑脱或扭曲成角造成的梗阻及胆漏. 总之, 高质量的供肝获取，熟练的吻合技术，尽量缩短无肝期是决定成败的关键. 改进的术式操作简便,成功率高,大大方便了其普及应用. 【参考文献】 ［1］ Lee S, Charters AC, Chandler JG, et al. A technique for orthotopic liver transplantation in the rat［J］. Transplantation,1973,16(6):664-669. ［2］ Kamada N,Calne RY. Orthotopic liver transplantation in the rat. Techniques using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage［J］.Transplantation,1979,28(1):47-50. ［3］ Inoue S, Tahara K, Shimizu H, et al. Rat liver transplantation for total vascular reconstruction, using a suture method［J］. Microsurgery,2003,23(5):470-475. ［4］ Tan F, Chen Z, Zhao Y, et al. Novel technique for suprahepatic vena cava reconstruction in rat orthotopic liver transplantation ［J］. Microsurgery， 2005,25(7):556-560. ［5］ 刘金彪,郑树国,张玉君,等. 提高大鼠原位肝移植手术质量的技巧和注意事项［J］. 中华器官移植植杂志,2005, 26(8): 500-502. ［6］ 马毅,何晓顺,陈规划.大鼠原位肝移植模型的手术技巧及并发症的预防［J］.中华显微外科杂志，2003,26(1)：45-47. ［7］ 徐峰,杨甲梅,阚彤,等. 改良Kamada法大鼠原位肝移植模型的建立［J］. 中华肝胆外科杂志,2001,7(12):758-759. ［8］ Tanaka H, Hashizume K, Enosawa S, et al. Successful transplantation of a 20% partial liver graft in rats: A technical innovation［J］. J Surg Res, 2003,110(2):409-412 |
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