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绿色荧光蛋白和成肌调节因子在骨髓基质干细胞中的共表达           ★★★ 【字体：小 大】
绿色荧光蛋白和成肌调节因子在骨髓基质干细胞中的共表达
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-9-30    
作者：李美山，张成，陈松林，于美娟，张雅妮，王淑辉，熊符
【关键词】  腺病毒
    Coexpression of both green fluorescent protein and myogenic regulatory factors in bone marrowderived mesenchymal stem cells
　　【Abstract】 AIM: To investigate the transfection of bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) by recombinant adenovirus (Ad), and the expressions of both green fluorescent protein (GFP) and myogenic regulatory factors, which are MyoD and Myogenin. METHODS: Rat MSCs were separated, cultured and expanded in vitro, and taken for identification of surface antigens by flow cytometry (FCM). AdGFP was amplified and identified to transfect MSCs. Expressions of both MyoD and Myogenin were detected in transfected MSCs by RTPCR. Differentiation of MSCs was induced by cocultured with C2C12 myoblasts, and MyoD expression was identified by immunofluorescence (IF). RESULTS: FCM showed that CD11b and CD45 were negative, CD29 and CD44 were positive in MSCs surface antigens. With the increasing of AdGFP multiple of infection (MOI), transfection rate were also increased. When MOI was over 100, cytopathic effect appears on MSCs. Expressions of both MyoD and Myogenin in transfected MSCs were approved by RTPCR; and MyoD protein can be found in induced MSCs by IF. CONCLUSION: MSCs can be effectively transfected by AdGFP and express GFP; and activation of intrinsic myogenic regulatory factors will enhance the myogenic differentiation of MSCs.
　　【Keywords】 mesenchymal stem cells; adenovirus; green fluorescent protein; C2C12; MyoD; Myogenin
　　【摘要】 目的：研究重组腺病毒（Ad）对骨髓基质干细胞（MSCs）的转染，以及绿色荧光蛋白（GFP）和成肌调节因子MyoD和Myogenin在MSCs中的表达. 方法：用差速贴壁法体外培养大鼠MSCs，并用流式细胞仪（FCM）检测其表面标志；对构建有绿色荧光蛋白的重组腺病毒（AdGFP）进行扩增和鉴定，并转染MSCs；用RTPCR检测MyoD和Myogenin在转染后MSCs中的表达；将MSCs与C2C12成肌细胞共培养，诱导前者的分化，并用免疫荧光检测MyoD的表达. 结果：FCM检测证实，在MSCs的表面标志中CD11b和CD45阴性，而CD29和CD44阳性；随着AdGFP感染复数（MOI）的增加，转染效率也相应提高，但在MOI大于100后，MSCs开始出现病变；RTPCR结果提示MyoD和Myogenin在转染后的MSCs中有表达；免疫荧光检测证实诱导后的MSCs可以表达MyoD蛋白. 结论：MSCs可以被AdGFP有效转染而表达GFP；同时内源性成肌调节因子的激活，可以促进MSCs的成肌分化.
　　【关键词】 基质干细胞；腺病毒；绿色荧光蛋白；C2C12；MyoD；Myogenin
　　0引言
　　骨髓基质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）具有向成骨、脂肪、神经以及肌肉等多种类型细胞分化的潜能，其易于分离和扩增的特性，使其成为细胞治疗的一种很有前景的治疗手段［1-3］. 为促使MSCs更好地定向分化，对其进行外源性基因修饰和/或内源性基因的激活，成为目前亟待解决的问题. 我们通过构建有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的５型重组腺病毒（AdGFP）转染大鼠的MSCs，并与C2C12成肌细胞共培养，通过激活内源性成肌调节因子，启动MSCs的成肌分化.
　　1材料和方法
　　1.1材料DMEM和1640培养基（Gibco公司）、胎牛血清（杭州四季青公司）、新生牛血清（Hayclone公司）、FITC荧光标记小鼠抗大鼠抗体（PharMingen and Serotec公司）、人胚肾293细胞和AdGFP（中山大学黄文林教授惠赠）、C2C12细胞（中山大学潘秋辉博士惠赠）、兔抗MyoD多克隆抗体（SantaCruz公司）、山羊抗兔cy3 IgG二抗（chemicon公司）. 健康雄性SD大鼠，清洁级，质量50~70 g，购于中山大学实验动物中心.
　　1.2方法
　　1.2.1大鼠骨髓MSCs的体外分离培养及鉴定将SD大鼠引颈处死后于无菌条件下分离出股骨和胫骨，用注射器冲出骨髓后，再经吹打制成单细胞悬液. 离心后弃上清，用加有胎牛血清（FCS）的DMEM重悬细胞，接种于培养瓶中培养2~3 d后换液. 约1~2 wk，细胞生长融合至80%时，用胰酶消化后传代培养至P4代以后生长均一，可用于实验. 常规消化MSCs，PBS洗3次，加入饱和浓度FITC荧光标记的小鼠抗大鼠CD11b, CD29, CD44和CD45抗体，室温下避光孵育30 min，再以PBS清洗，多聚甲醛固定，流式细胞仪（FCM）检测MSCs的表面抗原.
　　1.2.2293细胞的培养、AdGFP的扩增、纯化、滴度的测定及鉴定将293细胞培养在含100 mL/L新生牛血清的1640中培养约48 h，细胞生长至80%融合时传代培养. 当细胞生长至90%融合时，可用于AdGFP的扩增. 弃去培养基，加入AdGFP，再加含50 mL/L新生牛血清和35 g/L精氨酸的1640培养36~48 h. 当细胞出现病变效应（cytopathic effect，CPE）时，连同培养液一同收集在离心管中，室温1000 r/min，离心5 min，弃上清，加细胞裂解液，吹打均匀后冻存，在下次应用前，应于-80/37℃反复冻融3次，然后3600 r/min离心30 min，取上清接种至293细胞. 用CsCl2梯度离心法纯化病毒，用TCID50检测方法测定纯化后的病毒滴度约为8×109国际单位（IU）. 取病变后293细胞的裂解上清，按照酚氯仿抽提方法提取病毒DNA，进行病毒基因组E2b区的PCR检测. 正义引物为5′TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG3′， 反义引物为5′CATCTGAACTCAAAGCGTGG3′， 94℃预变性5 min，94℃变性1 min→53℃退火1 min→72℃延伸1 min，35个循环后，72℃延伸10 min.
　　1.2.3AdGFP转染MSCs将MSC平均接种于六孔板中（2×105/孔），加无血清的DMEM，约2~3 h后细胞完全贴壁，按照感染复数（multiple of infection, MOI）分别为10，20，50，100，150，200，300，400和500，依次接种相应剂量的AdGFP，2 h后，加含有FCS的DMEM孵育24 h. 消化并离心后再用无血清的DMEM重悬，用FCM检测转染效率. 检测所用激发光为488 nm，接收光为530 nm，用Cellquest软件进行数据获取与分析. 以未转染的细胞作为阴性对照，使阴性对照区细胞数不超过0.1%.
　　1.2.4转染前后MSCs的RNA提取及RTPCR反应取转染前后的MSCs提取总RNA. 按照试剂盒操作步骤进行逆转录，分光光度计测定cDNA的浓度和纯度后，再进行PCR扩增. MyoD的正义引物为5′CAACTGCTCTGATGGCATGATGG3′，反义引物为5′TGTTCTGCATCGCTTGAGGATGTC3′；Myogenin的正义引物为5′ACTACCCACCGTCCATTCAC3′， 反义引物为5′TCGGGGCACTCACTGTCTCT3′；βactin的正义引物为5′AGGCATCCTGACCCTGAAGTAC3′，反义引物为5′TCTTCATGAGGTAGTCTGTCAG3′，反应条件为94℃预变性3 min，94℃变性40 s→56℃退火40 s→72℃延伸1 min，35个循环后，72℃延伸10 min.
　　1.2.5转染GFP的MSCs与C2C12成肌细胞共培养后的免疫荧光检测将转染GFP后的MSCs与C2C12细胞按10∶1混合，接种于培养板中共同培养（密度为104/cm2），48 h后检测MyoD的表达. 先后用多聚甲醛固定的Triton破膜， H2O2和山羊血清分别封闭，加兔抗MyoD（1∶100）于4℃过夜，山羊抗兔cy3（1∶200）孵育，DAPI（1∶5000）复染后观察.
　　2结果
　　2.1MSCs的传代、扩增、纯化及表面标志测定骨髓细胞悬液在接种24 h后开始贴壁，呈散在圆形分布；72 h后可见球形和梭形细胞生长. 培养5~7 d可见明显分裂增殖的细胞，形成形态均一的细胞增殖集落. 培养至10 d左右，90%以上的细胞趋于融合，传代后6~8 h以内细胞基本贴壁. 24 h后开始增殖，细胞集落增多，呈“旋涡状”生长. 3 d后可传代，连续传4~5代后趋于纯化（图1）. FCM检测MSCs表面标志，其结果的均一性较好，其中造血干细胞的表面标志CD11b和CD45表达阴性，而CD29和CD44表达阳性（图2）.
　　图1P4代的MSC呈“旋涡状”生长×40（略）
　　A：CD11b阴性；B：CD29阳性；C：CD44阳性；D：CD45阴性.
　　图2检测MSCs表面标志的流式细胞图（略）
　　2.2AdGFP在293细胞中的表达及鉴定AdGFP在转染293细胞约6~8 h，就可以在荧光显微镜下见到绿色荧光，后者随着时间的延长而逐渐增多，24 h左右，绿色荧光最为强烈（图3）. 约在36~48 h出现CPE，表现为：90%~100%的细胞肿胀变圆并离散，部分聚集呈葡萄状，10%~20%的细胞漂浮（图4）. 本研究中所用重组腺病毒的E2b区为不可缺少的功能单位，将病变293细胞的裂解上清提取病毒DNA，进行E2b区的PCR鉴定，得到一条861 bp的片段（图5），提示腺病毒结构完整.
图3AdGFP转染293细胞24 h所表达的绿色荧光  ×200（略）
　　2.3AdGFP转染MSCs及其效率MSCs在感染AdGFP后，GFP的表达以24 h最为稳定（图6）. 当MOI值（MOI=病毒滴度/所转染的细胞数）分别为10，20，50，100，150，200，300，400和500时，FCM测得相应的转染率依次为48.7，64.8，72.1，89.1，89.9，93.1，94.4，95.8和96.8（%）（图7），MOI从10~100时候，转染率增加最显著，随后尽管大幅度增加病毒的剂量，但其转染效率不再明显增加，同时细胞病变明显，脱落细胞增多，因此以100作为最佳的MOI来感染MSCs.
　　图4约36~48 h出现病变效应的293细胞表现肿胀变圆、部分已经漂浮  ×200（略）
　　M: 10 000 bp Marker; 1: E2B (861 bp).
　　图5PCR检测AdGFP的E2b区基因表达的电泳图（略）
　　图6AdGFP转染MSCs 24 h所表达的绿色荧光  ×100（略）
　　图7AdGFP对MSCs的转染率（略）
　　2.4成肌调节因子在转染后MSCs mRNA水平上的表达AdGFP转染后的MSCs经RTPCR扩增，分别得到长度与目的基因MyoD（267 bp）和Myogenin（233 bp）相符的片断（图8），其中后者的表达量较少，二者与未经转染的MSCs的表达量相比无差别.
　　M: 600 bp Marker; 1: βactin (388 bp); 2: MyoD (267 bp); 3: Myogenin (233 bp).
　　图8RTPCR检测MyoD和Myogenin基因在转染后MSCs中表达的电泳图（略）
　　2.5免疫荧光检测成肌调节因子在MSCs中的表达绿色荧光提示表达有GFP的MSCs，红色荧光提示表达有MyoD的细胞核（MSCs或C2C12细胞），蓝色荧光是对全部细胞核的复染. 只有同时出现三种颜色荧光的阳性细胞核，才是MyoD阳性的MSCs（图9）. 经检测未见Myogenin的表达.
　　3讨论
　　MSCs作为骨髓干细胞中的一种，含量很少（在骨髓中的全部有核细胞中仅占0.001%~0.01%），但它们可以被高效地分离与扩增，并在特定的培养条件下，被诱导向多种谱系细胞（如骨骼、脂肪、软骨和肌肉）分化，因此在再生医学和组织工程方面倍受关注［1-3］. 对表面抗原的研究表明，MSC表达多种细胞黏附分子，后者在干细胞的附着与归巢方面发挥着作用［4］，在本研究中，经FCM检测显示大鼠MSCs主要表达CD29和CD44分子.
　　A: GFP阳性的MSCs； B: MyoD阳性的细胞； C: DAPI复染的细胞核.
　　图9MyoD在与C2C12成肌细胞共培养后的MSCs中的表达  ×200（略）
　　GFP是源于水母的一种稳定的荧光团，具有操作简便、可视性强并且不需要外源底物等优点而成为细胞学研究的首选工具［5］. 通过其在活细胞或组织中的表达，而达到观察后者形态和功能的变化的目的［5］. 重组腺病毒在不依赖细胞分裂的情况下，可以将目的基因转运至多种类型的哺乳动物细胞，并高水平表达，因此成为转基因的一种首选载体［6］. AdGFP结合了GFP的示踪特性和腺病毒转染率高的特点，转染MSC以后表达迅速而持久，有助于对细胞进行有效地示踪观察. 本研究采用流式细胞仪测定转染效率，避免了人工计数可能带来的误差，敏感性和客观性均得到提高［7］.
　　成肌调节因子基因家族包括MyoD，Myf5，Myogenin和MRF4，其中MyoD和Myf5在胚胎早期骨骼肌谱系的决定（determination）中起着关键作用，而Myogenin和MRF4则是发育中期成肌细胞向骨骼肌细胞进一步分化（differentiation）所必需的［8-9］. 在本研究中，转染GFP后的MSCs在mRNA水平仍然表达MyoD和Myogenin，提示前者的成肌潜力在受到腺病毒转染以后并未受到影响. Thayer等研究表明，通过激活内源性的成肌调节因子，可以形成向成肌性细胞分化的正反馈调节环路［10］. C2C12细胞是小鼠C2成肌细胞的一种亚克隆，代表着肌肉分化的早期阶段，在不同的培养条件下，即可以作为成肌细胞不断增殖，也可以向肌管分化［11-12］. 本研究利用该细胞的成肌特性，与MSCs共培养，诱导后者向成肌方向分化. 免疫荧光检测结果显示与C2C12细胞共培养后的部分MSCs可以表达MyoD，但未见Myogenin的表达，考虑与MSCs尚处于诱导分化的早期阶段有关. 目前认为，通过共培养的方法诱导分化的机制主要与微环境的影响、细胞之间的融合或接触有关［12］.
　　本研究结果提示：构建绿色荧光蛋白的腺病毒可以有效转染骨髓基质干细胞并稳定表达荧光；通过与成肌细胞共培养，可以激活内源性成肌调节因子，一定程度上促使骨髓基质干细胞向肌肉细胞定向分化.
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