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| 卵巢癌组织KLK11基因的表达意义 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-4  |
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【关键词】 卵巢癌；KLK11；RT Expression and significance of gene KLK11 in ovarian cancer 【Abstract】 AIM: To explore the expression of KLK11 gene and its clinical significance in human ovarian cancer. METHODS: RTPCR and immunohistochemistry were used to detect the expression of KLK11 mRNA and protein in 48 patients with ovarian cancer. The relation between the expression and the clinicopathological changes was analyzed statistically. RESULTS: KLK11 protein was found in the cytoplasm. Expression of KLK11 at mRNA and protein levels showed significantly higher in the patients at the advanced stages （Ⅲ or Ⅳ） compared to the early stages (Ⅰor Ⅱ) （P<0.05）, and it was significantly higher in the patients with poor or moderate cancer differentiation than the ones with high differentiation（P<0.05）. On the other hand, no significant association was found between KLK11 expression and histological typing of ovarian carcinoma. CONCLUSION: KLK11 expression might be related to the malignancy of ovarian carcinoma. 【Keywords】 ovarian cancer; KLK11; reverse transcriptasepolymerase chain reaction; immunohistochemistry 【摘要】 目的： 探讨卵巢癌KLK11基因中的表达及临床意义. 方法： 采用RTPCR和免疫组化技术检测48例卵巢癌组织中KLK11 mRNA及其蛋白的表达，并分析其与临床病理资料的关系. 结果： KLK11蛋白表达位于细胞质. KLK11 mRNA及蛋白的表达与临床分期有关，晚期（Ⅲ, Ⅳ期）KLK11 mRNA及蛋白的表达水平明显高于早期（Ⅰ, Ⅱ期，P<0.05），中低分化癌KLK11 mRNA及蛋白的表达明显高于高分化癌（P<0.05），但KLK11 mRNA及蛋白的表达与组织学类型无关. 结论： KLK11基因表达可能与卵巢癌的恶性程度有关. 【关键词】 卵巢癌；KLK11；RTRCR；免疫组织化学 0引言 卵巢癌死亡率占女性生殖系统恶性肿瘤的首位，至今发病机制尚未阐明，缺乏有效的早期诊断和治疗方法［1］. 人激肽释放酶基因家族Kallikrein（KLK）广泛存在于各种组织和体液中，编码相应的激肽释放酶HK, 参与多种生理和病理过程. Borqono等［2］发现70%的卵巢癌患者血清中HK11水平升高，提示KLK11在卵巢癌中可能存在异常表达. 我们采用逆转录―聚合酶链式反应（RTPCR）和免疫组化技术检测卵巢癌组织KLK11 mRNA及蛋白的表达，并结合临床病理特征进行分析,旨在探讨KLK11基因的表达与卵巢癌发病的关系，并初步探讨其发生机制. 1材料和方法 1.1材料 200411/ 200608首发卵巢癌手术新鲜标本48例，术前未经放化疗. 年龄35－75（平均55）岁. 切除卵巢均经患者同意. 按FIGO（1986年）修订的原发性卵巢恶性肿瘤的分期标准进行临床分期，Ⅰ期6例，Ⅱ期12例，Ⅲ期20例，Ⅳ期10例. 按WHO卵巢肿瘤组织学类型分类： 浆液性囊腺癌27例，粘液性囊腺癌13例，透明细胞癌5例，子宫内膜样腺癌3例. 按WHO分级标准并参照细胞分化程度分3 级：低分化10例，中分化22例，高分化16例. 新鲜肿瘤组织约2 cm×2 cm×1.5 cm立即放入液氮中速冻，转存于-70℃冰箱，用于提取mRNA. 其余部分用40 g/L中性甲醛固定，石蜡包埋，用于HE和免疫组化染色. 1.2方法 1.2.1RTPCR检测KLK11 mRNA采用RTPCR，用Trizol试剂（购自凯基生物公司）一步法提取细胞总mRNA，用AMV逆转录酶将其反转录成cDNA, βactin作为内参照基因. KLK基因和βactin均由上海英骏生化公司合成，KLK11基因引物正链：5′CCGCTACATAGTTCACCTGG3′，反链：5′AGGTGTGAGGCAGGCGTAACT3′，扩增片断为296 bp. βactin cDNA特异性引物作为对照. PCR反应条件： 95℃变性4 min, 95℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s，循环35次，最后72℃延伸5 min. PCR反应产物经过15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪观察拍照，应用Dolphin DUL软件分析癌灶及正常卵巢组织中KLK11 mRNA/βaction mRNA相对表达比. 1.2.2免疫组化检测KLK11蛋白表达采用SABC法，SABC试剂盒购自迈新生物公司. 石蜡包埋切片，切片厚4 μm，脱蜡水化，阻断内源性过氧化物酶，微波修复抗原，羊血清封闭室温孵育，鼠抗人KLK11(mAb, 1∶600，购自Abcam公司)，4℃过夜，滴加生物素标记的羊抗鼠IgG，室温下孵育，滴加SABC复合物，DAB/H2O2液显色，中性树胶封片. PBS代替一抗为阴性对照. ; KLK11阳性染色为棕黄色颗粒，采用德国Leica RX250型图像分析系统对免疫组化阳性染色进行定量分析，每张切片任选5个视野，测量每张切片阳性染色相对面积（阳性细胞面积/镜下细胞及间质总面积×100%）和阳性染色的灰度值. 统计学分析： 应用SPSS11.0软件对KLK11基因表达情况进行统计学分析，不同临床病理分级及组织学类型间基因表达阳性率的比较用χ2检验进行，切片阳性染色积分灰度值组间比较用方差分析进行. P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1KLK11 mRNA表达KLK11 mRNA表达与卵巢癌临床病理特征关系密切（图1，表1）. 随临床分期增加KLK11基因的mRNA表达水平增高，晚期卵巢癌（ⅢⅣ期）KLK11基因mRNA表达水平明显高于早期卵巢癌（ⅠⅡ期）（P<0.05）；中低分化卵巢癌KLK11 mRNA表达明显高于高分化卵巢癌（P<0.05）；KLK11 mRNA表达与卵巢癌组织学类型无关（P>0.05）. M: DL2000 marker; N1, N2, N3: 正常卵巢; T1: Ⅲ期卵巢癌; T2: Ⅱ期卵巢癌; T3: Ⅰ期卵巢癌. 图1RTPCR检测KLK11基因mRNA表达（略） 表1卵巢癌KLK11 mRNA表达(略) aP<0.05 vsⅠⅡ期; bP<0.01 vs中低分化. 2.2KLK11基因蛋白表达免疫组化阳性染色为棕黄色颗粒沉淀，位于癌细胞的细胞质（图2）. KLK11蛋白在Ⅲ, Ⅳ期卵巢癌中阳性表达高于Ⅰ, Ⅱ期卵巢癌, 差异有统计学意义（P<0.05）；在中低分化卵巢癌中阳性表达高于高分化卵巢癌,差异有统计学意义（P<0.05,表1）；在浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、子宫内膜样腺癌及透明细胞癌中阳性表达无明显差别（P>0.05）. 图2晚期卵巢癌组织KLK11表达SABC ×400（略） 3讨论 人激肽释放酶（kallikrein）基因家族是编码丝氨酸蛋白酶的一组同源基因，串连排列在19q1314染色体上，包括KLK1 KLK15，它们都参与血管张力与通透性的维持，各种生长因子的裂解和激活，调节神经系统可塑性以及皮肤表面细胞脱落与再生等众多生理过程［3］. 许多激肽释放酶在与激素相关的器官中表达，如乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌. Yousdf等［4］发现在卵巢癌细胞株中至少有7种激肽释放酶表达；除KLK8外，所有激肽释放酶都在乳腺中表达；大多数激肽释放酶在前列腺和睾丸中也有不同程度表达［5］. KLK11基因已被证实在人的许多组织中均有表达，包括卵巢、大脑、皮肤、唾液腺、胃、前列腺、肠、子宫、脾、肝、甲状腺、乳腺等组织中［6］. 我们利用半定量RTPCR、免疫组化检测KLK11在卵巢癌中的表达，研究结果表明，KLK11基因在卵巢癌组织中的表达随着临床分期进展，表达有增高趋势，提示KLK11基因在卵巢癌的发展过程中可能起一定作用. 通过对卵巢癌组织学分级的分析，表明低分化卵巢癌KLK11的表达较高，而高分化卵巢癌KLK11的表达低，提示KLK11基因可能与卵巢癌的恶性度有关. 由于丝氨酸蛋白酶的蛋白水解作用，进一步推测KLK11基因可能与肿瘤的生长、扩散、转移有关. 用半定量PCR检测64例卵巢癌组织和10例正常卵巢组织中KLK11基因的表达，发现肿瘤中mRNA表达明显增高，而且HK11蛋白在卵巢癌组织中表达丰富，提示KLK11在卵巢癌中过度表达，可能导致肿瘤细胞的生长、扩散和潜在转移［7］. 最近发现KLK家族不同成员可能受到共同机制调节并参与卵巢癌的发生和发展过程［8］. 【参考文献】 ［1］ 乐杰. 妇产科学［M］. 北京: 人民卫生出版社，2002:334. ［2］ Borqono CA, Fracchioli S, Yousef GM. Favorable prognostic value of tissue human kallikrein 11 (hK11) in patients with ovarian carcinoma［J］. Cancer, 2003,106(4):605-610. ［3］ 俸家富，李少林. 人组织激肽释放酶与癌症［J］. 现代医药卫生2004，20（1）:21-24. ［4］ Yousdf GM, Polymeris ME, Yacoub GM, et al. Parallel overexpression of seven kallikrein genes in ovarian cancer ［J］. Cancer Res, 2003,63(9):2223-2227. ［5］ 李钟， 莫曾南. klk基因研究进展［J］. 广西医学，2005，27(9):1399-1401. ［6］ Diamandis EP, Okui A, Mitsui S, et al. Human kallikrein 11: a new biomarker of prostate and ovarian carcinoma ［J］. Cancer Res, 2002,62:295-300. ［7］ Shigemasa K, Lijun GU, Tanimoto H, et al. Human kallikrein gene 11 （klk11) mRNAoverexpression is associated with poor prognosis in patients with epithelial ovarian cancer ［J］. Clin Cancer Res, 2004,10:2766-2700. ［8］ Eleftherios P, Diamandis GM. Yousef human tissue kallikrein: A family of new cancer biomarker ［J］. Clin Chemistry, 2002, 48(8):1198-1205 |
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