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温肾健脾方对大鼠慢性创面愈合的影响           ★★★ 【字体：小 大】
温肾健脾方对大鼠慢性创面愈合的影响
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-4    
作者：曹永清，何春梅，陆金根
【关键词】  创面愈合
    ［摘要］  目的：探讨温肾健脾中药对慢性创面愈合的影响及可能作用机制。方法：采用大鼠背部开放性创面模型，用肌注氢化可的松的方法造成慢性难愈性创面，以辛葡康为阳性对照药，应用免疫组化、流式细胞术等方法，观察创面愈合时间、新生上皮宽度、肉芽组织形态学变化、肉芽组织细胞周期、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、转化生长因子β1 (transforming growth factorβ1, TGFβ1)及纤维连接蛋白(fibronectin, FN)等指标。结果：温肾健脾方治疗组与辛葡康对照组平均创面愈合时间分别为（17.0±1.9）和（18.8±1.9） d，较模型组及空白组明显缩短（P<0.05）；治疗14 d后，治疗组及对照组新生上皮宽度分别为（3.73±0.19）和（3.21±0.15）mm，较模型组及空白组明显增宽（P<0.05）；治疗组新生毛细血管丰富，成纤维细胞数量多，而对照组、模型组及空白组新生毛细血管及成纤维细胞数量均较治疗组明显减少（P <0.05）；治疗组S期细胞比例较对照组、模型组及空白组明显提高（P<0.05）；治疗组及对照组与模型组及空白组比较，EGF、TGFβ1、FN蛋白表达均增强（P<0.05）。结论：温肾健脾方有促进大鼠慢性难愈创面修复的作用，其机制与调节细胞周期，上调EGF、TGFβ1细胞因子蛋白表达水平，促进间质FN的表达有关。
    ［关键词］  中药疗法; 创面愈合; 肉芽组织; 组织学比较; 细胞因子
      Effects of Wenshen Jianpi Recipe on chronic wound healing in rats
        ABSTRACT  Objective: To study the effects of Wenshen Jianpi Recipe (WSJPR, a traditional Chinese medicine for warming kidney and invigorating spleen) on chronic wound healing and the mechanism. Methods: Ninetysix SD rats were randomly divided into 4 groups, with 24 rats in each group, and back wound was made in the rats. For rats in 3 of the 4 groups, hydrocortisone injection was administered to induce chronic wound. Rats in 2 of the 3 groups were treated with WSJPR and Xinpukang Granules (XPKG) respectively, and the rats in the other group were untreated. The rats in the fourth group were taken as control. The wound healing time and the width of new epidermis were observed, and the histomorphological changes and cell cycle of the granulation tissue, and the protein expressions of epidermal growth factor (EGF), transforming growth factorβ1 (TGFβ1) and fibronectin (FN) in the granulation tissue were tested with immunohistochemical technique and flow cytometry. Results: The wound healing time of the WSJPRtreated and XPKGtreated groups was (17.0±1.9) and (18.8±1.9) d respectively, much shorter than that of the untreated and control groups (P<0.05). On the 14th experiment day, the width of new epidermis of the WSJPRtreated and XPKGtreated groups was (3.73±0.19) and (3.21±0.15) mm respectively, much wider than that of the untreated and control groups (P<0.05). The numbers of angiogenesis, fibroblasts and cells in the S phase in WSJPRtreated and XPKGtreated groups were much higher than those in the untreated and control groups (P<0.05). Compared with the untreated and control groups, the protein expressions of EGF, TGFβ1 and FN in WSJPRtreated and XPKGtreated groups were higher (P<0.05). Conclusion: WSJPR can enhance the wound healing. It was likely through accelerating the cell proliferation and upregulating the expressions of EGF, TGFβ1 and FN.
    KEY WORDS  pharmacotherapy, TCM; wound healing; granulation tissue; histology, comparative; cytokines
    肛肠病术后创面愈合周期较长，或长期不易愈合，本课题旨在证实温肾健脾中药内服有促进慢性创面愈合的作用，并主要从组织形态学及细胞因子角度探讨其作用机制。
    1  材料和方法
    1.1  实验材料
    1.1.1  实验动物  实验用清洁级SD大鼠96只，雄性，体质量180~220 g，由上海中医药大学实验动物中心提供。
    1.1.2  实验药物  温肾健脾方由黄芪、茯苓、肉桂、当归、刺五加组成，制备成含生药1 g/ml的中药水煎浓缩液，备用。辛葡康冲剂由杭康生物药业有限公司生产，批号20010211。
    1.1.3  实验试剂与仪器  氢化可的松琥珀酸钠，50 mg/支，天津市生物化学制药厂生产，批号20010419；表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)兔抗大鼠多克隆抗体，Oncogene公司产品；转化生长因子β1(transforming growth factorβ1, TGFβ1)兔抗大鼠多克隆抗体、纤维连接蛋白(fibronectin, FN)山羊抗大鼠多克隆抗体，Santa公司产品；AHBT5B通用研究显微镜，Olympus公司产品；流式细胞仪，美国BectonDickson公司产品。
    1.2  造模方法  参照傅小兵等［1］全层皮肤缺损法制成动物体表溃疡模型。SD大鼠常规饲养1周后，腹腔注射盐酸氯胺酮150 mg/kg，麻醉后造模区（腰椎正中偏上）剪毛，用直径20 mm塑料瓶盖在造模区标记造模面积，新洁而灭酊棉球皮肤消毒，沿标记线剪去皮下组织至肌筋膜，止血，消毒纱布敷料覆盖伤口，分笼单独饲养，自由进食饮水。次日起，模型组、治疗组及对照组均肌注氢化可的松琥珀酸钠100 mg/kg，隔日1次，共注射7次。
    1.3  动物分组及给药
    1.3.1  动物分组  采用完全随机方法分组。每组24只大鼠，共分四组，即温肾健脾方实验组（以下简称治疗组）、辛葡康阳性对照组（简称对照组）、模型组，以上3组背部造成创面后，均肌注氢化可的松琥珀酸钠；空白组(正常创面组)，造模后不作处理。
    1.3.2  给药及取材  给药剂量按《中药药理实验方法学》［2］中人鼠等效剂量换算，治疗组自造模次日起以温肾健脾方中药水煎剂灌胃，2 ml/次，1次/d；对照组以0.1 g/ml辛葡康冲剂灌胃，2 ml/次，1次/d；模型组及空白组均以等量生理盐水灌胃。各组均分两次取材。灌胃至第7天，每组各取8只动物处死后，取创面修复组织（主要是新生肉芽组织），一分为二，分别放置于新鲜生理盐水及10%中性甲醛固定液中，一部分做细胞周期测定，另一部分用于形态学观察及免疫组化法检测肉芽组织中EGF、TGFβ1表达。灌胃至第14天，取8只动物处死，测量新生上皮宽度，并取创面肉芽组织，10%中性甲醛固定，免疫组化法检测肉芽组织中FN的表达。其余8只继续灌胃至创面愈合。
    1.4  观察指标与方法
    1.4.1  创面愈合时间  造模之日起至创面愈合所需的时间。
    1.4.2  新生上皮宽度  灌胃14 d后，测量各组新生上皮的宽度。沿创缘前后及创缘左右各取4点（每点相对于创面中点的连线各成90o），用游标卡尺测量各点新生上皮的宽度，取平均值。
    1.4.3  形态学观察  造模后第8天创面中央肉芽组织取材，生理盐水冲净血污，10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片厚约5 mm，常规HE染色，光学显微镜观察每高倍（10×40）视野下各组肉芽组织毛细血管（完整管腔）、纤维母细胞数及坏死程度，并用计分法表示，计分标准如下。毛细血管：无，计0分；1~5个，计1分；6~10个，计2分；>10个，计3分。纤维母细胞：无，计0分；1~30个，计1分；31~50个，计2分；>50个，计3分。坏死程度：无坏死，计0分；坏死少，计1分；坏死较多，计2分；坏死多，计3分。
    1.4.4  肉芽组织细胞周期测定  造模后第8天创面中央肉芽组织取材，新鲜组织置于生理盐水中，样品处理后制成单细胞悬液，碘化丙啶标记，避光静置30 min，流式细胞仪检测，自动拟合出细胞周期各时相比例。
    1.4.5  免疫组化ABC法检测EGF、TGFβ1和FN表达  标本甲醛固定，石蜡包埋，切片厚约5 μm，脱蜡至水，PBS冲洗3次，每次5 min,柠檬酸缓冲液微波处理，92～100 oC，10 min, PBS冲洗3次，每次5 min,每片加1滴第一抗体，37 oC，90 min, PBS冲洗3次，每次5 min,滴加Envision试剂，室温下放置60 min, PBS冲洗3次，每次5min,滴加新配制的DAB显色液，显微镜下控制显色3～10 min,自来水冲洗，苏木素复染45 s，中性树胶封片。显微镜下观察，有棕黄染色者为阳性。采用Leica全自动图像分析系统，对各组免疫组化切片进行图像分析。根据各组切片中染色条件，在统一阈值下进行。（1）输入图像：在200倍显微镜下，每张切片随机选取3个视野。（2）测量参数：测定各组在统一光度下阳性细胞的积分光密度（integral optical density, IOD）。
 1.5  统计学方法  采用SSPS 10.0软件，创面愈合时间、新生上皮宽度、肉芽组织形态学指标积分、细胞周期测定、EGF、TGFβ1、FN阳性细胞的积分光密度均采用方差分析的方法作组间差异的比较。
    2  结  果
    2.1  大鼠创面愈合时间及第14天新生上皮宽度  治疗组及对照组平均创面愈合时间分别为（17.0±1.9）和（18.8±1.9） d，比模型组及空白组明显缩短（P<0.05）；治疗14 d后，治疗组及对照组新生上皮宽度分别为（3.73±0.19）和（3.21±0.15） mm，较模型组及空白组明显增宽（P<0.05）。见表1。
    2.2  大鼠造模后第8天创面肉芽组织形态学观察  每组随机抽取6张切片，光镜下观察造模后第8天创面修复组织，见治疗组新生毛细血管丰富，成纤维细胞数量多，炎细胞浸润少，而对照组、模型组及空白组新生毛细血管及成纤维细胞数量均较治疗组明显减少，差别有统计学意义（P<0.05）。见表2。
    2.3  大鼠造模后第8天创面肉芽组织细胞周期测定  治疗组S期细胞比例较对照组、模型组及空白组明显提高(P<0.05)，其中模型组S期细胞比例最低。见表3。
    2.4  大鼠造模后第8天创面肉芽组织EGF、TGFβ1及第14天创面FN蛋白表达  每组8个标本中随机挑选4个做EGF、TGFβ1及FN的免疫组化和图像分析，观察阳性细胞的IOD，结果显示治疗组及对照组EGF、TGFβ1、FN蛋白表达均增强，两组之间无差异，而治疗组与模型组及空白组比较差异显著（P<0.05）。见表4。 表1  创面愈合时间及实验第14天新生上皮宽度 表2  创面中央肉芽组织形态学检查平均积分表3  创面肉芽组织细胞周期测定表4  创面肉芽组织EGF、TGFβ1和FN蛋白表达
    3  讨  论
    3.1  氢化可的松造成慢性创面脾肾阳虚型动物模型的探讨  一般认为肾上腺皮质类固醇是延迟组织修复的药物，其主要机制是抑制炎症反应、抑制胶原合成和促进蛋白分解等［3］。Brown等［4］认为醋酸氢化可的松是血管生成的拮抗剂，有明显的抑制血管再生作用。我们应用傅小兵等［1］全层皮肤缺损体表溃疡模型，术后肌注氢化可的松造成慢性损伤性模型。实验结果表明，与正常创面组比较，模型组平均创面愈合时间延长、新生上皮较慢，在一定程度上反映了慢性创面愈合周期长的特点。
    大剂量皮质激素给予大鼠7~10 d以后，可以造成“阳虚”模型，动物表现为体质量减轻、活动减少、反应迟钝、蜷曲拱背等“阳虚”表现［5］。实验过程中发现，肌注氢化可的松4次后，开始出现上述症状。本实验采用氢化可的松抑制创面愈合的模型，力求做到既能符合临床辨证的实际，又能体现慢性创面的愈合过程，以探讨温肾健脾中药促进难愈性创面修复的机制。
    3.2  温肾健脾方促进慢性创面愈合的作用机制探讨
    3.2.1  通过影响生长因子，调控修复细胞增殖以促进创面愈合  创伤修复过程中成纤维细胞、内皮细胞等修复细胞的分裂增殖是愈合过程的重要组成部分，在此过程中总是伴随着生长因子的释放与参与。其中TGFβ1、EGF是重要的参与创面修复的生长因子，在大鼠切口创伤模型中，TGFβ1是最早表明能加速正常创伤愈合的生长因子。TGFβ1促进创伤修复作用主要表现在诱导炎症细胞中的中性粒细胞和巨噬细胞向创伤部位补充；促进成纤维细胞的增殖和细胞基质的合成；促进角化细胞迁移，减少创伤体积，加速愈合速度。EGF对内皮细胞和成纤维细胞有趋化性刺激作用，使其向受损部位迁移，且能促进成纤维细胞合成胶原蛋白。本实验结果表明中药治疗组与模型组和空白组相比有上调TGFβ1、EGF蛋白表达作用，说明温肾健脾中药促创面愈合作用与调控TGFβ1、EGF的表达有关，从而参与创面修复的各个阶段。
    细胞修复首先进行DNA的复制，然后以分裂方式进行增殖，促进DNA的复制对促进细胞分裂有直接影响，DNA作为细胞的遗传物质，是决定细胞生长分裂等的重要因素。创面修复是皮肤细胞不断地活化增殖的过程，当细胞分裂增殖时，细胞周期中的G0期细胞不断进入S期，使S期细胞数增加，DNA的合成和含量就增加。本实验流式细胞仪分析结果模型组S期细胞比例较其他组明显降低，而治疗组与模型组相比，有所增高，差别有统计学意义，表明氢化可的松有抑制修复细胞增殖作用，而温肾健脾中药治疗组在一定程度上有提高细胞周期中S期细胞比例的作用，这可能是温肾健脾中药促愈作用机制之一。
    3.2.2  通过影响基质的合成，发挥促进创面愈合作用  FN是一类分子量为450 kD的糖蛋白。FN参与创面愈合过程的所有阶段，其重要作用有作为趋化因子诱导外周血中的单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞、成纤维细胞向伤口运动；作为一种非特异性调理素，调动吞噬系统清除病菌及组织碎片，净化伤口；FN介导人成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞等与各种细胞外基质的结合；FN对基质的产生有调节作用［6］。本实验结果表明造模14 d时，局部组织中FN含量模型组最低，而治疗组和对照组与模型组相比，均有升高，表明氢化可的松有抑制FN合成的作用，而温肾健脾中药能提高局部FN含量，这可能也是该药促创面愈合的作用途径之一。
    3.2.3  改善局部微循环，以促进慢性创面愈合  伤口局部微循环一方面保证再生所需的氧和营养，另一方面对坏死组织的吸收及控制局部感染也起重要作用。当微循环改善，局部血流恢复时受损的组织也得到修复，因此微循环紊乱的改善对组织修复有根本性意义。本实验中局部组织形态学结果显示，模型组局部毛细血管数目较少、管腔小，坏死比较明显，而温肾健脾中药组毛细血管数目多、管腔大，坏死不明显，在一定程度上说明该方有改善局部微循环，增加局部血液灌流量，从而为创面修复中细胞的增殖、胶原的合成等提供良好的血运，这可能也是该药促创面愈合的作用途径之一。
    ［参考文献］
    1  傅小兵, 王亚平, 常国友, 等. 碱性成纤维细胞生长因子促进受创皮肤再生的实验研究［J］. 中国修复重建外科杂志, 1996, 10(1): 2325.
    2  陈  奇. 中药药理实验方法学［M］. 北京: 人民卫生出版社, 1994. 176.
    3  傅小兵, 王德文. 创伤修复基础［M］. 北京: 人民军医出版社, 1997. 182.
    4  Brown KJ, Maynes SF, Bezos A, et al. A novel in vitro assay for human angiogenesis［J］. Lab Invest, 1996, 75(4): 539555.
    5  陈  奇. 中药药理研究方法学［M］. 北京: 人民卫生出版社, 1993. 982.
    6  陈星伟. 纤维结合蛋白在创伤愈合中的作用［J］. 中华创伤杂志, 1990, 6(4): 245247
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