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血小板第4因子对急性放射损伤小鼠骨髓基质细胞的保护作用           ★★★ 【字体：小 大】
血小板第4因子对急性放射损伤小鼠骨髓基质细胞的保护作用
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-9-30    
作者：高瑛，杨岚，田琼，方恒虎，聂蕾，刘水冰，卫张蕊
【关键词】  骨髓基质细胞
    Protective effects of platelet factor 4  on bone marrow stromal cells of acute radiation injury in mice
　　【Abstract】 AIM:  To investigate the protective effects of platelet factor 4 (PF4) on bone marrow stromal cells (BMSCs) of radiated mice and to study the protective mechanism of hematopoietic radiation injury in mice. METHODS:  Forty male mice were randomized to four groups (R, R+P, N+P and N) and two of groups (R, R+P) were exposed wholebodily to 5.0 Gy 60Co γrays. The mice were treated with injections of PF4 (50μg/ kg), ip twice at an interval of 6 h and 20 h. After the second injection, they were irradiated. The cell cycle and apoptosis of bone marrow stromal cells (BMSCs) cultured in vitro after radiation were analyzed by FACS after ten days culture. The expression of p27kip1 in the cells was detected using immunohistochemistry. RESULTS:  The 24th hour adhesion rate of BMSC in radiated mice respectively reached 37%, 58%, 74% and 79.3%. The cell percentage of G0+G1 phase increased and those of G2+M decreased in R group, compared with those in R+P, N+P and N groups. But the DNA content of the radiated group of BMSC decreased remarkably compared with those in the other three groups. The expression of p27kip1 was downregulated compared with that of BMSC without PF4 protection. CONCLUSION:  The protective effects of PF4 on BMSCs with radiated injury probably result from the inhibition of the expression of p27kip1.
　　【Keywords】 marrow stromal cells; platelet factor 4; radiation injuries; radiatior protection; p27
　　【摘要】 目的： 探讨血小板第4因子(platelet factor 4, PF4)对小鼠5.0 Gy γ射线全身照射后骨髓基质细胞（bone marrow stromal cell, BMSC）的保护作用，进一步探讨PF4对造血的辐射防护机制. 方法： 40只雄性小鼠随机分为4组： ① 单纯放射组（R），② 放射＋PF4组（R+P），③ 正常＋PF4组（N+P），④ 正常对照组（N）. 小鼠照射前分别于26和20 h ip PF4，每次剂量50 μg/ kg. 于照射后3 d取BMSC体外培养，倒置显微镜下观察贴壁细胞生长状况，并于培养10 d后用流式细胞仪测定贴壁细胞的细胞周期和DNA含量，免疫组化（SP法）检测细胞p27kip1表达. 结果： 放射损伤小鼠BMSC 24 h贴壁率4组依次为37％, 58%, 74%, 79.3%；流式细胞仪检测结果表明R组G0+G1期细胞显著高于其余3组，而G2+M期细胞显著低于其余三组，DNA含量显著低于其余3组；R组p27kip1表达明显强于其余3组. 结论： PF4对放射损伤的BMSC有保护作用，可能与抑制p27kip1表达有关.
　　【关键词】 骨髓基质细胞；血小板因子4；辐射损伤；辐射防护；p27
　
　　0引言
  
　　造血功能障碍是放射损伤时最基本的病理变化. 此时的造血功能障碍涉及造血干/祖细胞和造血基质细胞损伤. 骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell, BMSC)是造血诱导微环境(hematopoietic inductive microenvironment, HIM)的重要组成成分.  血小板第4因子(PF4)能可逆地抑制造血干细胞、祖细胞的生长，又是骨髓细胞调节的负调节因子,并因此而保护骨髓造血干祖细胞免受辐射和细胞毒剂的损伤［1，2］. 在本实验中我们首次以体外培养放射损伤小鼠的BMSC为基础，观察PF4对其的保护作用，进一步探讨PF4对放射损伤的保护机制.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　BABL/c健康雄性小鼠40只，体质量22~24 g，第四军医大学实验动物中心提供；RPMI1640培养基（Gibco）；PF4（Sigma）：用双蒸水稀释成工作液,置4℃冰箱保存备用,稀释浓度为100 mg/L；特级小牛血清、马血清（杭州，四季青）；胰酶（Sigma）；P27kip1, SP试剂盒及DAB显色试剂盒（武汉博士德）.
　　1.2方法
　　60Co γ射线一次全身均匀照射,吸收剂量为5.0 Gy,吸收剂量率为 221.09 cGy/min，距离100 cm. 实验随机分4组，每组10只小鼠： ① 单纯放射组（单放组，R）： 5.0  Gy 60Co γ射线全身照射；②放射＋PF4组（R+P）： 放射前26和20 h给予PF4 ip，50 μg/kg，照射方式和剂量同①组；③正常＋PF4组（N＋P）：PF4注射时间及剂量同②组，但不照射；④正常对照组（N）： 不照射及PF4注射.  BMSC原代培养参照Dexter方法［3］： BABL/c小鼠颈椎脱位处死,在无菌条件下分离双侧股骨,冲洗骨髓腔,制成单细胞悬液. RPMI1640培养体系中含100 mL/L新生牛血清，150 mL/L马血清，青、链霉素100 kU/L, 1 μmol/L氢化考的松, 50 mL/L CO2饱和湿度,37℃条件下扩增BMSC. 第1次3 d后半量换液，以后每隔5 d半量换液. 在倒置显微镜下观察细胞生长状态及细胞形态.  取25 mL的培养瓶，各组6个，接种细胞5×105/瓶，每4 h取1瓶，倒去培养液，2.5 g/L胰酶消化，计数贴壁细胞，计算每个时间点的贴壁率（贴壁率＝已贴壁细胞数/接种细胞数×100%）.  将各组BMSC用2.5 g/L胰酶消化后生理盐水制成单细胞悬液，700 mL/L乙醇固定,溴化丙啶染色,用流式细胞仪分析细胞周期和DNA含量. 另p27kip1表达的免疫组化染色（SP法）：BMSC 2×109/L 接种于孔底预先铺好1 cm2经过酸处理过的细胞玻璃爬片的24孔板，经完全培养基培养10 d后取出玻片，950 mL/L乙醇固定，严格按照说明书操作. 行HE染色对照. 用PBS替代一抗作为阴性对照.
　　统计学处理：　实验结果均以x±s表示，使用SPSS10.0软件，均数间差别用单因素方差分析，均数间多重比较使用LSDt检验.
　2结果
 
　　2.1BMSC形态和贴壁率刚接种的BMSC呈圆形，大小不一；d 3更换培养液时，各组细胞形态有差别：R组贴壁细胞数量较少，无成纤维样细胞形成；R＋P组可见散在分布的贴壁细胞克隆，有成纤维样细胞出现；N+P组细胞形态多样，呈三角形、圆形、成纤维样；N组细胞形态同N+P组. 7～10 d，R组散在分布贴壁细胞克隆，形态以圆形为主，少量成纤维样；R+P组成纤维样细胞数量明显多于R组；N＋P组成纤维样细胞明显增多，呈集落样生长；N组成纤维样细胞较N＋P组多，且连接成片. 4组BMSC 24 h贴壁率依次为R组37%，R+P组58%，N+P组74%，N组79.3%.
　　　　　　
　　2.2细胞周期和DNA含量R组的G0+G1期细胞显著高于R+P组，G2+M期细胞显著低于R+P组；而N+P组与N组均无显著差异. DNA含量R组明显低于其余3组（Tab 1）.表15.0 Gy照射后BMSC的细胞周期和DNA含量（略）
　　2.3p27kip1蛋白表达胞质可见弥漫散在棕色颗粒为p27kip1蛋白阳性表达,胞核无阳性表达. R组胞质棕色颗粒较其余3组明显多，即p27kip1过度表达(Fig 1).
        
　　3讨论
　　造血微环境中的基质细胞发生各种损伤时,则有可能对维持正常的造血过程产生不同程度的影，且一旦受到损伤,其功能障碍和(或)其增殖能力损伤的修复甚为困难,机体造血功能的恢复也必然受到严重的影响. 因此,在辐射损伤引起的严重造血障碍中,基质细胞的功能障碍可能起着非常重要的作用［4］. 一般认为,造血基质细胞的辐射敏感性低于造血干细胞. 本实验提示： PF4可能具有保护基质细胞的黏附功能的能力［5］.
  　　
　　对于放射损伤后骨髓基质细胞周期分析的研究报道很少,而有关PF4对其影响的研究更缺乏可比性的资料.  在本实验中，R组G0+G1期细胞显著高于其余3组，说明放射损伤使BMSC产生了 “G1期阻滞” ；同时辐射对DNA直接造成了损伤，使BMSC DNA含量减少；而R+P组S期细胞增加，这同Kitajima等［6］的研究结果相同. 也同PF4对造血细胞的保护机制相同，将细胞阻滞于S期［7］.
 　　
　　p27可抑制多种cyclinCDK 复合物的活性, 对细胞周期进行负调控. 我们发现该蛋白在R组高表达，且阳性表达于细胞质，而R+P组的表达与其它组有显著差异，这与放射损伤造成R组基质细胞“G1期阻滞”相一致. 　　另外，我们还发现PF4对正常BMSC无明显的保护作用. 总之本研究证实了放射损伤对BMSC “G1期阻滞”，阐明了PF4对放射损伤的BMSC的保护机制，也进一步证实了基质细胞在造血防护中的重要地位，为临床造血防护的治疗方案提供帮助.
　　【参考文献】
　　［1］   田琼，杨岚，张发科，等. 血小板第4因子对小鼠急性照射小鼠造血保护作用的实验研究［J］. 中华血液学杂志，2000;20（6）:416-418.
　　Tian Q, Yang  L, Zhang FK, et al. Protective effect of platelet factor 4 on acute hematopoietic radiation injury in mice and its mechanism ［J］. Chin J Radiol Med Prot, 2000；20（6）：416-418.
　　［2］ 杨岚，宋俊玲，田琼. 血小板第4因子造血保护作用的实验研究［J］. 西北国防医学杂志,2003；24（3）：188-190.
　　Yang L, Song JL, Tian Q. Hemaprotective effects of platelet factor 4(PF4) ［J］. Med J NDFNC, 2003；24(3)：188-190.
　　［3］ Dexter TM, Moore MAS, Sheridan APC. Maintenance of he mapoietic stem cells and production  of differentiated progeny in allogeneic and  semi allogeneic bone marrow chimeras in vitro ［J］. J Exp Med, 1977;145(6):1612.
　　［4］ Ueno H, SakitaIshikawa M, Morikawa Y, et al. A stromal cellderived membrane protein that supports hematopoietic stem cells ［J］. Nat Immunaol, 2003;4(5):457-463.
　　［5］ Han P, Guo XH, Story CJ. Enhanced expansion and matuation of megakaryocytic progenitors by fibronectin ［J］. Cytotherapy, 2002;4(3):277-283.
　　［6］ Kitajima K, Kojima M, Kondo S, et al. A role of yumomji gene in proliferation but not differenfiation of megakaryocyte lineage cells ［J］.  EXP Hematol, 2001; 29 (4): 507-514.
　　［7］ 顾宏涛,杨岚,田琼，等. WR2721, PF4对于全身照射条件下小鼠造血系统保护作用的比较［J］. 第四军医大学学报,2003;24(21):2006-2008
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