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H4受体介导组胺刺激AtT           ★★★ 【字体：小 大】
H4受体介导组胺刺激AtT
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-9-30    
作者：孟嘉，谢建军，杨铁虹，王海芳，李明凯，胡静,罗晓星
【关键词】  组胺
　　【Abstract】 AIM:  To clarify the subtype of histamine (HA) receptor which mediates Adrenocorticotropic Hormone(ACTH) release   from mouse anterior pituitary tumor cell line AtT20. METHODS:  ELISA assay was used to determine the effects of a variety of histamine receptor subtypespecific agonists and antagonists on ACTH release from AtT20 cells. The expression of H4 receptor mRNA on AtT20 cells  was detected by RTPCR and the PCR product was sequenced. RESULTS: ① HA (108 mol/L) significantly accelerated the release of ACTH (pmol/L) from AtT20 cells （5.7±1.1 vs 2.7±0.6 in control, P<0.01）. The histamine H1receptor specific antagonist Chlorpheniramine (5.7±0.7) and histamine H2receptor specific antagonist Ranitidine (5.8±1.0) did not inhibit the effect of HA.  ② The same as HA, histamine H3 and H4receptor agonist R(α)Methylhistamine (10-7 mol/L) increased the release of ACTH from AtT20 cells （5.9±1.3）. ③  H4receptor specific antagonist JNJ777120 (1［(5Chloro1Hindol2yl)carbonyl］ 4methylpiperazine) demonstrated a concentrationdependent inhibitory effect on the   increasing ACTH secretion induced by HA, and the effect of HA was totally abolished by JNJ777120 at 10-5 mol/L. ④ RTPCR confirmed that AtT20 cells  presented an endogenous expression of H4receptor mRNA. CONCLUSION:  HA stimulates the release of ACTH from AtT20 cells through H4 receptor mediation.
　　【Keywords】  histamine; receptors, histamine H4; AtT20 cell; corticotropin
　　【摘要】  目的： 阐明介导小鼠垂体前叶瘤细胞株(AtT20)分泌促肾上腺皮质激素（ACTH）的组胺（HA）受体亚型.  方法： 体外培养AtT20细胞，ELISA检测各HA受体亚型的激动剂和拮抗剂对AtT20细胞分泌ACTH的影响；利用RTPCR方法检测AtT20细胞中H4受体mRNA的表达. 结果： ① HA （10-8 mol/L）作用于AtT20细胞6 h，ACTH分泌量（pmol/L）增加 （5.7±1.1）,与对照组相比（2.7±0.6）有显著差异（P<0.01）； 而组胺H1受体特异性拮抗剂扑尔敏(5.7±0.7)和H2受体特异性拮抗剂雷尼替丁 (5.8±1.0)不能拮抗此效应.  ② HA H3和H4受体激动剂R(α)甲基组胺（10-7 mol/L）同HA作用相似，能够促进AtT20细胞分泌ACTH（5.9±1.3）. ③ HA H4受体的特异拮抗剂JNJ777120 (1［(5Chloro1Hindol2yl)carbonyl］4methylpiperazine)能够剂量依赖性拮抗HA促进AtT20细胞释放ACTH的效应，当浓度为10-5 mol/L时，HA的效应被完全阻断. ④ RTPCR结果证实，在AtT20细胞中存在组胺H4受体mRNA的内源性表达.  结论： HA调控AtT20细胞分泌ACTH的作用由H4受体介导.
　　【关键词】 组胺；受体，组胺H4；AtT20细胞；促肾上腺皮质激素
　　0引言
　　组胺(histamine, HA)是生物体内具有功能活性的一种重要物质，通过不同的HA受体调节多种生理功能. HA能够调节垂体分泌促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic  hormone, ACTH)，该效应被认为是由H3受体介导的［1］. 但是近年来的研究发现［2］，这一结论还存在一些无法解释的疑点. 2000年H4受体首次被发现［3］，随着对其研究的深入［4］，许多研究结果提示HA调节ACTH释放的效应极有可能是由H4受体介导的，而并非H3受体. 本研究采用能够特异性分泌ACTH的小鼠垂体前叶瘤细胞系（AtT20）为模型，观察ACTH的释放是否由HA H4受体调节，以明确HA促进ACTH分泌的机制，为深入研究HA的免疫调节作用提供新的线索，并可为临床治疗异位ACTH综合征提供新的思路.
　　1材料和方法
　　1.1材料AtT20细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所（从美国ATCC引进，编号：CRL1795）；DMEM高糖培养液购自美国Gbico公司；新生牛血清购自杭州四季青生物材料研究所；L谷氨酸、组胺、雷尼替丁、扑尔敏及R(α)甲基组胺购自美国Sigma公司；ACTH检测试剂盒购自美国Market公司；JNJ777120 (1［(5Chloro1Hindol2yl)carbonyl］4methylpiperazine，JNJ)由美国强生公司Robin L. Thurmond博士馈赠； Trizol,反转录酶 (SuperScript Ⅲ)购自美国Invitrogen公司； Taq酶购自日本Takara公司；Balb/c小鼠由第四军医大学实验动物中心提供.
 
　　1.2方法
　　1.2.1细胞培养将AtT20细胞株, 接种于含100 mL/L新生牛血清，4 mmol/L谷氨酰胺的DMEM高糖培养液中，置于950 mL/L O2, 50 mL/L CO2孵箱中培养，以后每2~3 d以2.5 g/L胰酶消化后按1∶3传代. 所使用的细胞均为处于指数增长期，且在传代20代以内的细胞.
 
　　1.2.2HA受体激动剂和拮抗剂对AtT20细胞分泌ACTH的影响将AtT20细胞以2×105 个/孔的密度接种于24孔板，24 h后换用不含血清的培养液，并按实验分组设计加入不同浓度的各种HA受体激动剂及拮抗剂，6 h后收集各孔上清液，离心去除脱落细胞，按照试剂盒操作步骤进行ELISA测定，根据标准曲线换算所含ACTH的浓度. 实验共分A~I 9组，分别为A：  基础状态； B：  组胺(10-8 mol/L)；C： HA（ 10-8 mol/L）+ 扑尔敏(10-5 mol/L)；D： HA（ 10-8 mol/L）+ 雷尼替丁( 10-5 mol/L)；E： R(α)甲基组胺(10-7 mol/L)；F ：HA（ 10-8 mol/L）+ JNJ( 10-8  mol/L)；G： HA（ 10-8 mol/L）+ JNJ( 10-7 mol/L)；H： HA（ 10-8 mol/L）+ JNJ( 10-6  mol/L)；I： HA（ 10-8 mol/L）+ JNJ( 10-5 mol/L). 每组各设一个复孔，每组试验重复6次.
 
　　1.2.3RTPCR检测H4受体mRNA的表达用Trizol 处理AtT20细胞和成年Balb/c小鼠的垂体，提取总RNA. 小鼠中按H4受体在Genebank中的编号为gi: 15420534，全长1538 bp，扩增HA H4受体mRNA所用引物：上游引物5′ATGCGGAGTCTAACAGTACTGG3′ ，下游引物5′GAAGATACTGACTGGTTCT3′［8］. 使用随机引物反转录，反应参照试剂盒说明进行操作；PCR反应条件：94℃ 5 min； 94℃ 1 min，53℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸5 min.反应结束后产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳, 以凝胶成像系统观察并记录电泳结果, 回收并测序.
 
　　统计学处理：  数据以x±s表示，采用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差分析. P<0.01认为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1细胞培养对传代l~8 d后的细胞进行观察，并用OLYPUS（IX71）倒置荧光生物显微镜拍照. 细胞消化分散后呈小圆形，传代l d后单个细胞呈梭形或三角形，体积较小， 细胞中央隐约可见细小圆形颗粒；2~4 d后细胞体积逐渐增大, 单个细胞呈梭状，岛状或枫叶状，有的呈多角形或簇状接合，部分体积较大的细胞开始融合，细胞中央颗粒明显可见（图1）；5~6 d，大部分细胞融合紧密，有的已呈层叠生长，并出现细胞脱落，同时在大片融合细胞的边缘可见新生出的梭状小细胞；至8 d细胞脱落明显，个别区域呈大片脱落，原已融合成片的细胞层块中央呈空穴状.
 
　　图1光学显微镜下AtT20细胞形态×400（略）
　　2.2HA受体激动剂和拮抗剂对AtT20细胞分泌ACTH的影响给与HA(10-8  mol/L)刺激6 h后AtT20细胞的ACTH分泌量(5.7±1.1)pmol/L较基础状态(2.7±0.6)pmol/L 显著增加(P<0.01)；而在给与HA的同时给与H1受体拮抗剂扑尔敏 (10-5  mol/L)或H2受体拮抗剂雷尼替丁（10-5  mol/L），ACTH分泌量分别为(5.7±0.7)pmol/L和 (5.8±1.0)pmol/L，与HA组相比无明显差异，即不能拮抗HA的作用. 当给与H3受体和H4受体的激动剂R(α)甲基组胺（10-7  mol/L）， ACTH分泌量（5.9±1.3)pmol/L较基础状态显著增加( P<0.01）.
　　HA促进ACTH释放的效应可为特异性H4受体阻断剂JNJ所拮抗，且具有明显的剂量依赖性，当JNJ浓度增至10-5 mol/L时，ACTH的分泌量同基础状态相比无统计学差异， HA促进ACTH释放的效应被完全阻断（图2）.
　　A: 基础状态；  B: HA (10-8 mol/L)；    F: HA (10-8 mol/L)＋JNJ(10-8 mol/L)；G: HA (10-8 mol/L)＋JNJ(10-7 mol/L)；  H:HA (10-8 mol/L)＋JNJ(10-6 mol/L)；I: HA (10-8 mol/L)＋JNJ(10-5 mol/L).    aP<0.01 vs基础状态; bP<0.01 vs HA (10-8 mol/L).
图2H4受体特异性拮抗剂JNJ对HA刺激AtT20细胞释放ACTH的影响（略）
　　2.3H4受体mRNA的表达取AtT20细胞及正常Balb/c小鼠垂体RNA的RTPCR产物各5 μL行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪成像，可见一大小为1185 bp特异性条带，而阴性对照孔（以总RNA为模板直接PCR）的相应位置处未见条带(图3). 将所得片段切胶回收送检测序. 将测序结果与Genebank中的小鼠HA H4受体序列（gi: 15420534）BLAST对比完全吻合，说明AtT20细胞中以及小鼠垂体中均有HA H4受体mRNA的表达.
　　M: DL2000 marker;  1, 2: H4受体在AtT20细胞及小鼠垂体表达的RTPCR产物; 3,4: H4受体在AtT20细胞及小鼠垂体表达的阴性对照
　　图3AtT20 细胞中及小鼠垂体HA H4受体mRNA的表达（略）
　　3讨论
　　H4受体为2001年新发现的HA受体亚型，其氨基酸序列与H1， H2受体同源性较低，而与H3受体的同源性较高，在跨膜区其同源性高达58%，这使得它们在药理学特性上也存在交叉重叠现象［3］. 包括RAMHA及thioperamide在内的大多数H3受体的特异配体对H4受体也有作用，只是亲和力不同［5］.  本实验结果显示，H1和H2受体特异拮抗剂扑尔敏及雷尼替丁无法拮抗HA促进AtT20细胞分泌ACTH的效应；同时，HA H3, H4受体的激动剂RAMHA（10-7 mol/L）可以模拟同等强度的HA (10-8 mol/L)促进ACTH释放效应，这与H4受体的动力学特点相符；而HA H4受体的高选择性特异拮抗剂JNJ［6］能够特异性拮抗HA的作用，且有明确的剂量效应关系；此外，在AtT20细胞中检测到内源性H4受体mRNA的表达. 以上研究结果表明HA调控AtT20细胞分泌ACTH的作用是由H4受体介导的.
 
　　HA H4受体主要分布在外周组织，高表达于与炎症反应相关的组织和造血细胞中，故目前对H4受体的研究多集中于免疫和造血以及干细胞分化等方面的功能［7-9］. 本研究表明H4受体介导HA刺激AtT20细胞分泌ACTH，同时亦在正常小鼠的垂体组织中检测到H4受体mRNA的表达. 小鼠与人的H4受体同源性高达69%［4］，提示HA刺激人垂体分泌ACTH的作用可能也由H4受体介导.
　　ACTH在中枢神经系统具有神经损伤后的恢复与再生及学习记忆等多种生理功能. 脑内肿瘤或脑创伤时，常影响下丘脑功能，出现下丘脑垂体机能失调而使ACTH分泌相对不足. 临床研究证明脑肿瘤、脑外伤时提高血中ACTH的浓度，可明显改善和恢复脑细胞的功能并缓解意识障碍、头痛、呕吐等症状. 本研究证明了HA H4受体可以调控AtT20细胞分泌ACTH，为临床脑肿瘤及脑外伤的治疗及术前准备提供新的思路，为深入研究HA的免疫调节作用提供新的线索，并为临床治疗异位ACTH综合征提供新思路.
　　【参考文献】
　　［1］ Clark MA, Korte A, Myers J, et  al. High affinity histamine H3 receptors regulate ACTH release by AtT20 cells ［J］. Eur J Pharmacol, 1992,210:31-35.
　　［2］ 谢建军, 罗晓星,赵德化. 组胺H3受体对垂体瘤AtT20细胞分泌ACTH的调节作用［J］. 第四军医大学学报, 2001,22:584-586.
　　［3］ Oda T, Morikawa N, Saito Y, et al. Molecular cloning and characterization of novel type of histamine receptor preferentially expressed in leukocytes ［J］. J Biol Chem, 2000,275:36781-36786.
　　［4］ Liu C, Wilson SJ, Kuei C, et a1. Comparison of human, mouse, rat, and guinea pig histamine H4 receptors reveals substantial pharmacological species variation ［J］. J Pharmacol Exp Ther, 2001,299(1):121-130.
　　［5］ Hough LB. Genomics meets histamine receptor: new subtypes, new receptor ［J］. Mol Pharmacol, 2001,59:415-419.
　　［6］ Thurmond RL, Desai PJ, Dunford PJ, et al. A potent and selective histamine H4 receptor antagonist with antiinflammatory properties［J］. J Pharmacol Exp Ther, 2004,309(1):404-413.
　　［7］ Hofstra CL, Desai PJ, Thurmond RL, et al. Histamine H4 receptor mediates chemotaxis andcalcium mobilization of mast cells ［J］. J Pharmacol Exp Ther, 2003,305:1212-1221.
　　［8］ Thurmond RL, Desai PJ, Dunford PJ, et al. A potent and selective histamine H4 receptor antagonist with antiinflammatory propertyes ［J］. J Pharmacol Exp Ther, 2004,309(1):404-413.
　　［9］ Ling P, Ngo K, Nguyen S, et al. Histamine H4 receptor mediates eosinophil chemotaxis with cell shape change and adhesion molecule upregulation ［J］. Br J Pharmacol, 2004,142:161-171
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