今天是：  | 网站首页 | 名校推荐 | 小学试卷 | 初中试卷 | 高中试卷 | 免费课件 | 免费教案 | 如何获点 | 
  | 教育教学 | 免费论文 | 网站留言 | 
您现在的位置： 名校试卷网 >> 医学论文 >> 医药卫生 >> 正文 用户登录 新用户注册
紫杉醇和吉西他滨对鼻咽癌HNE2细胞系 协同放射增敏的作用           ★★★ 【字体：小 大】
紫杉醇和吉西他滨对鼻咽癌HNE2细胞系 协同放射增敏的作用
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-4    
【摘要】目的观察紫杉醇、吉西他滨两药联合对鼻咽癌细胞系HNE2的放射增敏作用，并探讨其可能机制。方法将HNE2细胞分为单纯照射组、吉西他滨（GE）＋照射组、紫杉醇（PA）＋照射组及GE+PA+照射组，用克隆形成实验计算两药物单用及合用的放射增敏比，流式细胞仪法分别检测、比较各组的细胞凋亡率及细胞周期变化。Westernblot法测定各组细胞凋亡相关基因bcl2、bax的表达水平。结果吉西他滨、紫杉醇及两药联合使用的放射增敏比分别为1.06、1.13和1.34。流式细胞仪检测显示吉西他滨联合射线主要诱导S期阻滞（96.03％），诱导凋亡率为31.62％；紫杉醇联合射线引起的阻滞以G2＋M期为主（75.71%），诱导细胞凋亡率为44.56%；两药合用并联合照射后G2＋M期比例（65.98%）有所下降，同时S期比例（33.33%）有所上升（与PA+放射组比较），细胞凋亡率达到73.28%。在四组中bcl2的表达呈逐步下降趋势，而bax的表达则呈逐步上升趋势。结论吉西他滨、紫杉醇单用及两药联合对鼻咽癌细胞系HNE2均有放射增敏作用，且两者协同增敏作用显著高于单独增敏作用，显示了两药联合应用有助于提高鼻咽癌的放射敏感性。两者协同放射增敏作用的机制可能与凋亡有关。

【关键词】紫杉醇吉西他滨鼻咽癌放射增敏

0引言

放射治疗一直是治疗鼻咽癌的首选方法。近年来已有作者报道分别将紫杉醇[1]（Paclitaxel，PA）和吉西他滨[2]（Gemcitabine，GE）联合放射治疗鼻咽癌，以增加其放射敏感性，但两药联合使用增加放射敏感性的报道尚属少见。本试验选用鼻咽癌细胞株HNE2作为研究对象，研究了紫杉醇和(或)吉西他滨联合放射对HNE2细胞增殖、凋亡的影响，以探讨PA和GE协同作用对HNE2细胞的放射敏感性的影响及其可能机制。

1材料和方法

1.1细胞株、药物和试剂人鼻咽癌HNE2细胞株购自湖南湘雅医学院肿瘤研究所。紫杉醇和吉西他滨分别为美国百时美施贵宝公司及礼来公司产品。兔抗人多克隆第一抗体及生物素标记的第二抗体由北京中山生物技术有限公司提供，系美国SantaCruz产品。噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma公司，RPMI－1640、胰蛋白酶购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。

1.2细胞及培养条件人鼻咽癌HNE2细胞株培养于含有10%胎牛血清的PRMI1640培养基中，添加100IU/ml青霉素及链霉素，37℃、100%湿度、5%CO2条件下常规培养。

1.3MTT法测定药物IC50及IC10值HNE2细胞按103/孔接种于96孔培养板，待16～18h后贴壁生长至对数生长期时，将PA用培养基依次稀释为500μg/ml、50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0.05μg/ml、0.005μg/ml，分别按100μl/孔加入96孔板，每一浓度设3复孔，并设正常对照孔及空白调零孔。同法将HNE2细胞按5×103/孔接种于96孔培养板，GE依次稀释为2000μg/ml、200μg/ml、20μg/ml、2μg/ml、0.2μg/ml、0.02μg/ml加入96孔板。置37℃培养箱孵育24h后，弃去药物及陈旧培养基，每孔加新鲜配制的MTT（5mg/ml）20μl再次孵育4h，弃去MTT液，每孔加DMSO150μl，振荡15min，酶联免疫检测仪于490nm波长测定吸光度D。重复3遍。肿瘤细胞抑制率＝（1实验组吸光度/对照组吸光度）×100%

1.4克隆形成实验测定药物放射增敏性将正常细胞、GE作用24h后细胞、PA作用24h后细胞及两药联合作用（浓度同上）24h后细胞组常规消化后分别按不同照射剂量以不同密度接种于60mm培养皿，每组细胞给予6MVX射线单次照射0、2、4、6、8Gy，恒温箱中培养12d。12d后取出培养皿，弃去培养基，PBS清洗2遍，甲醇固定15min，去除固定液，姬姆萨染色30min，对含50个细胞以上的克隆进行计数。多靶单击模型拟合细胞存活曲线并计算增敏比。 论文网在线 www.lunwenwang.com

1.5流式细胞分析将培养于50ml培养瓶中呈对数生长的HNE2细胞随机分为：（1）单纯照射组、（2）GE＋放射组、（3）PA＋放射组、（4）两药联合＋放射组。单纯照射组仅给予6Gy照射，其余三组分别给予GE（0.2μg/ml）、PA（0.1μg/ml）及GE和PA的混合液作用24h后弃药并照射6Gy。以上四组共同孵育24h，常规消化后800r/mim离心5min，弃上清，PBS清洗2遍，80%乙醇4℃固定过夜，离心去乙醇，PBS清洗2遍，用RNase（终浓度0.02mg/ml）、PI（终浓度0.1mg/ml）及0.3%的TritonX100混合配制成的PI染液避光染色30min，流式细胞仪分析细胞周期及凋亡情况。

1.6WesternBlot法测定bcl2、bax的表达分组及每组处理方法同1.5，将四组细胞常规消化后置EP管800r/min离心5min，弃上清，PBS清洗2遍，每管加新鲜配制的裂解液100μl，4℃裂解30min，随后4℃12000r/min离心15min，吸上清，每个样本均分装成5μl及60μl两管，－20℃保存。将5μl/管蛋白加上样buffer沸水煮5min，BCA法测样本蛋白浓度。用15%的SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样本蛋白，电转移至硝酸纤维素滤膜上，与兔抗人bcl－2及bax多克隆抗体4℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化酶标记的二抗，室温孵育1h，ECL显色，X射线片显影。实验重复3遍。

1.7统计学处理所用数据均以均数±标准差表示，结果用SPSS13.0统计软件进行t检验。

2结果

2.1GE及PA的IC50和IC10值MTT实验表明不同浓度梯度的PA及GE作用细胞24h后，细胞抑制率随药物浓度的增加而增加，结果见表1。应用IC50计算软件求出GE的IC50及IC10分别为173.2μg/ml和0.210μg/ml。PA的IC50及IC10分别为2.73μg/ml和0.13μg/ml。以下的实验均选用两种药物的大致IC10浓度0.2μg/ml（GE）和0.1μg/ml（PA）。表1GE及PA对HNE2细胞的生长抑制作用

2.2GE、PA及GE+PA对细胞放射敏感性的影响将正常细胞、GE、PA作用后细胞及两者联合作用后细胞分别给予0、2、4、6、8Gy射线照射后多靶单击模型拟所得结果如图1。单纯对照组细胞存活曲线的D0=3.17，Dq＝1.73；GE组的D0=2.99，Dq＝1.52；PA组的D0=2.8，Dq＝1.44；联合用药组的存活曲线与前三组相比明显下移，肩峰变窄，D0=2.37，Dq＝1.07。吉西他滨的增敏比（单纯照射组D0与吉西他滨组D0之比值，以下类推）为1.06，紫杉醇的增敏比为1.13，而两药联合后的增敏比为1.34，明显高于两药分别使用时的增敏比(P<0.05)。

2.3不同处理对细胞周期及细胞凋亡的影响图2显示四组细胞经不同处理后的细胞周期分布。单纯照射6Gy引起的阻滞以G2＋M期（36.92±0.76）%为主；紫杉醇联合照射可进一步诱导G2＋M期阻滞（75.71±0.51）%；吉西他滨联合射线引起的阻滞以S期（96.03±0.25）%为主；两药联用并联合放射后G2＋M期比例（65.98±0.59）%有所下降，同时S期比例（33.33±0.73）%有所上升（与PA+放射组比较）。图3显示四组细胞经不同处理后均出现不同程度的凋亡，其中以PA+GE+放射组最为明显（73.28±0.37）%，显著高于其中任一单药联合放射后引起的细胞凋亡率（31.62±0.64）%或（44.56±0.62）%,P<0.05。

2.4对bcl－2及bax表达的影响WesternBlot检测得到bax在GE+PA+放射组、PA+放射组、GE+放射组及单纯照射组各组中的表达呈逐步下降趋势，而bcl－2在上述各组中的表达呈逐步上升趋势，见图4、5。(略) 3讨论

鼻咽癌的治疗目前仍以放射治疗为主,早期鼻咽癌通过放射治疗可以取得良好的疗效，但Ⅲ、Ⅳ期单独放射治疗的疗效仍较差，其五年存活率仅为30%～55%[3]。局部复发与远处转移是治疗失败的主要原因，因此探讨放化疗合理的联合应用以提高NPC治愈率是目前研究的重点之一。

吉西他滨是一种新的脱氧胞苷类似物，在体内及体外实验中已进行了对非小细胞肺癌、胰腺癌及头颈部肿瘤的放射增敏性研究，取得了很好的疗效[2,4,5]。其放射增敏的作用机制为[6]：使细胞周期重分布，周期敏感细胞增加；直接渗入细胞DNA，抑制其修复；使细胞dATP池耗竭，影响细胞DNA生物合成，导致细胞凋亡。紫杉醇是一种新型抗微管药物。国外研究表明紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌[7]及头颈部肿、非小细胞肺癌[1,8]等多种实体瘤细胞有放射增敏作用。但其确切作用机制仍不十分清楚。其中一个可能的机制是其通过抑制微管蛋白解聚使细胞阻滞于M期，因而也就提高了细胞的放射敏感性[7]。

本实验研究显示，吉西他滨对细胞周期的影响是将其阻滞于S期，而紫杉醇则是将其阻滞于G2＋M期，与文献报道相似[9,10]。同时研究还发现，两药协同作用后G2＋M期细胞比例有所下降，S期细胞比例增加，表现为吉西他滨部分逆转了紫杉醇所致的G2＋M期阻滞，但两药协同使HNE2细胞的总细胞周期进展得到显著阻滞，明显增强了它们抑制肿瘤细胞生长和诱导凋亡的作用，大大提高了其对肿瘤细胞的放射增敏作用。因此通过本实验证实了吉西他滨和紫杉醇协同作用使其同时从两个不同途径共同作用，诱导了鼻咽癌HNE2细胞的凋亡，显著提高了细胞的放射敏感性。

细胞中bax与bcl2蛋白的比例似乎可调控凋亡的发生[11]。研究发现在抗肿瘤药物诱导的细胞毒性中，凋亡是一个非常重要的现象。抗肿瘤药物诱导凋亡的分子机制是通过死亡受体依赖性和非依赖性通道介导的，与线粒体内膜上的电压依赖性阴离子通道释放的细胞色素C密切相关的，而细胞色素C的释放是通过包括Bid、bax和Bak在内的促凋亡蛋白和包括bcl2和bclX(L)在内的抗凋亡蛋白的相互作用来调控的[12]。本研究显示吉西他滨或紫杉醇与辐射联用均可使bcl2的表达下降，而使bax的表达上升，两药协同作用联合辐射后可进一步使bcl2的表达下降，而使bax的表达上升，说明两者协同作用并联合辐射后可进一步促进肿瘤细胞凋亡，提示两者协同显著增强鼻咽癌HNE2细胞的放射敏感性的机制可能与促进细胞凋亡及调控bax/bcl2的表达有关。

总之，本实验证明抗肿瘤新药吉西他滨与紫杉醇协同作用可以促进鼻咽癌HNE2细胞凋亡，抑制其细胞周期的进展，下调bcl2的表达并上调bax的表达，显著增强鼻咽癌HNE2细胞对射线的敏感性，从而为临床上同时利用两药协同射线治疗鼻咽癌提供了重要的实验依据。

【参考文献】

［1］ Bucci MK, Rosenthal DI, Hershock D. Final report of a pilot trial of accelerated radiotherapy plus concurrent 96hour infusional paclitaxel for locally advanced head and neck cancer\[J\]. Am J Clin Oncol， 2004 Dec，27(6):595602.论文网在线 www.lunwenwang.com

[2\] Eisbruch A, Shewach DS, Bradford CR,et al. Radiation concurrent with gemcitabine for locally advanced head and neck cancer: a phase I trial and intracellular drug incorporation study\[J\]. Clin Oncol, 2001,19(3):792799.

[3\] Al-Sarraf M, Reddy MS.Nasopharyngeal carcinoma\[J\].Curr Treat Options Oncol,2002, 3(1):2132.

[4\] Cesario A, Margaritora S, Trodella L,et al. Incidental surgical findings of a phase I trial of weekly gemcitabine and concurrent radiotherapy in patients with unresectable nonsmall cell lung cancer\[J\]. Lung Cancer, 2002,37(2):207212.

[5\] Wolff RA, Evans DB, Gravel DM,et al. Phase I trial of gemcitabine combined with radiation for the treatment of locally advanced pancreatic adenocarcinoma\[J\]. Clin Cancer Res,2001, 7(8): 22462253.

[6\] Lawrence TS, Blackstock AW, McGinn C.The mechanism of action of radiosensitization of conventional chemotherapeutic agents\[J\]. Semin Radiat Oncol, 2003,13(1):1321.

[7\] Chakravarthy A, Nicholson B, Kelley M，et al. A pilot study of neoadjuvant paclitaxel and radiation with correlative molecular studies in stage II/III breast cancer\[J\]. Clin Breast Cancer， 2000，1(1):6871.

[8\] Sarihan S, Kayisogullari U, Ercan I,et al. Randomized phase 2 study of radiotherapy alone versus radiotherapy with paclitaxel in nonsmall cell lung cancer\[J\]. J Int Med Res, 2004,32(4):375383.

\[9\] Pauwels B, Korst AE, Pattyn GG,et al. Cell cycle effect of gemcitabine and its role in the radiosensitizing mechanism in vitro\[J\]. Int J Radiat Oncol Biol Phys， 2003，57(4):10751083.

\[10\]Toiyama Y, Tanaka K, Konishi N,et al. Administration sequencedependent antitumor effects of paclitaxel and 5fluorouracil in the human gastric cancer cell line MKN45\[J\]. Cancer Chemother Pharmacol, 2005,(2):18.

\[11\]Zhang Z, Lapolla SM, Annis MG,et al. Bcl2 homodimerization involves two distinct binding surfaces, a topographic arrangement that provides an effective mechanism for Bcl2 to capture activated Bax\[J\]. J Biol Chem, 2004,279(42):4392043928.

\[12\]Kim R, Tanabe K, Uchida Y,et al. Current status of the molecular mechanisms of anticancer druginduced apoptosis. The contribution of molecularlevel analysis to cancer chemotherapy\[J\]. Cancer Chemother Pharmacol，2002，50(5):343352.
论文录入：guoxingxing    责任编辑：guoxingxing 
  • 上一篇论文：

  • 下一篇论文：
    • 【发表评论】【加入收藏】【告诉好友】【打印此文】【关闭窗口】
    　　网友评论：（只显示最新10条。评论内容只代表网友观点，与本站立场无关！）
    Copyright © 2003-2009 www.51shijuan.com All Rights Reserved.
    名校试卷网　版权所有 武汉明思教育咨询有限公司 公司注册号：420111000026640
    客服热线：13554027304 客服QQ:595216475 912259353 Email:51shijuan@163.com
    公司地址：武汉市洪山区珞瑜路1号鹏程国际 鄂ICP备07013297号
    建议浏览分辨率：1024*768