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明胶/壳聚糖创伤敷料的生物安全性评价           ★★★ 【字体：小 大】
明胶/壳聚糖创伤敷料的生物安全性评价
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-3    
作者：黄治林，姜广建，孟令军，谢艾玲，张义东，郑桓
【关键词】  壳聚糖
    Biosafety evaluation of gelatin/chitosan wound dressing
　　【Abstract】 AIM: To evaluate the biosafety of gelatin/chitosan wound dressing. METHODS: Cytotoxicity test, dermal stimulation test, allergic cutaneous test, hemolysis test and micronuclei test were conducted. RESULTS:  In cytotoxic test, the cultured fibroblast cells were found growing steadily and the morphology was similar  to that of the negative control group. No difference was observed in the cell activity between the study and control groups by MTT. The intradermic injection test found no stimulating reaction such as erythma and edema. The cutaneous allergic rate was 0 in the study group and the negative control group but the rate was 100% in the positive control group. Except for that in the positive control group, the hemolytic rate in all groups was lower than 1%, much lower than our national criteria of 5%. The micronuclei test showed that the micronucleus rate of the study group was 1.6‰, similar to that of the negative control group but was significantly different from that of the positive control group (P<0.0001). CONCLUSION: Gelatin/chitosan biomembrane has excellent biological properties in that it contains no pyrogen and allergen and no cutaneous stimulation. Its biosafety analysis shows a prosperous future of clinical application.
　　【Keywords】 gelatin; chitosan; wound dressing; biological tests
　　【摘要】 目的：对明胶/壳聚糖敷料进行生物安全性评价. 方法：进行皮肤刺激，皮肤致敏，细胞毒性和溶血实验，并按照统一的标准判定. 结果：皮内注射实验：各组各点局部无红斑、水肿反应； 皮肤致敏实验：试验组及空白对照组溶液家兔的致敏率为0%,而阳性对照组为100%,二者相比有显著性差异；溶血实验：除阳性对照组外,各组溶血率均在1%以内,符合规定不大于5%的标准；微核实验：材料浸提液组的微核率为1.6‰，与生理盐水对照组比较无显著性差异(P>0.05)，材料浸提液组与阳性对照组（微核率为20‰）比较有显著性差异(P<0.01)；细胞毒性实验：镜下见纤维细胞生长良好，形态和数量均和对照组无显著性差异，MTT法测得细胞活性和对照组无差别，细胞毒性总评级为0. 结论：明胶/壳聚糖生物膜不含致热原、致敏原，无皮肤刺激反应，不引起皮肤过敏反应，无溶血反应，生物安全性保证其可望用于临床.
　　【关键词】 明胶；壳聚糖；敷料；安全性评价
　　0引言
　　皮肤作为人体最大的器官，是与外界环境接触的屏障. 当由于损伤或疾病等因素造成皮肤缺损时，常常造成创面水分、电解质及蛋白质丢失，开放的创面还增加了感染的几率，早期有效地封闭创面可以减少上述并发症的发生. 本课题采用壳聚糖为主要基质材料，辅以胶原的部分变性产物明胶，制得生物相容性良好、可支持表皮细胞生长的壳聚糖/明胶敷料［1］. 我们前期实验已经证明其具有良好的柔韧性、吸胀性和透气功能，是烧（创）伤后新鲜创面覆盖敷料的良好选择. 为了保障该敷料应用于人体时安全无毒副作用，我们按照国家相关规定，对明胶/壳聚糖敷料进行生物安全性评价.
　　1材料和方法
　　1.1主要材料明胶/壳聚糖膜浸提液,Giemsa应用染液, 敌克松(Dexon)二氨基芴(2AF) 2.4二硝基氯苯甲醇,均为实验室自备；小牛血清由中国医学科学院血液研究室提供；L929细胞由中国医学科学院肿瘤研究所提供；大鼠、小鼠、白色豚鼠由中国医学科学院动物研究室提供.
　　1.2生物学相容性试验根据我国及ISO《生物材料和医用装置生物学评价试验项目》选择［2］.     浸提液的制备：按200 g/L分别将材料置于生理盐水和纯花生油中，分别在60~70℃浸提24 h，在121℃下浸提30 min，制得低温浸提液和高温浸提液，过滤后溶液经高温消毒（124℃，2 h），冷却，置37℃恒温箱中备用.
　　1.2.1细胞毒性试验［3］（直接接触法）将明胶/壳聚糖膜、医用涤纶无纺布（阴性对照组）及聚氯乙烯（阳性对照组）用蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干后剪成碎屑（碎屑要足够小，便于在显微镜下观察），用压力蒸汽灭菌121℃消毒30 min，将材料分别放入96孔培养板内，细胞培养板分3组（明胶/壳聚糖膜、阳性对照组、阴性对照组），每组12孔，每孔加入细胞培养液2 mL，置37℃培养箱内，24 h后取出备用. 将已培养48 h生长旺盛的L929细胞按下式（国家标准）计算出细胞密度（细胞数/mL）：
　　配制成4×104/mL的细胞悬液，取出96孔细胞培养板，分别加入细胞悬液0.5 mL，置37℃培养. 于培养后的第1，2，4，7 d，每组各取3孔进行细胞形态观察和细胞计数. 判定标准： 无毒细胞形态正常、贴壁生长良好，L929细胞呈棱形或不规则三角形；轻微毒细胞贴壁生长好，但可见少数细胞圆缩，偶见悬浮死细胞；中等毒细胞贴壁生长不佳，细胞圆缩较多，达1/3以上，见悬浮死细胞；严重毒细胞基本不贴壁，90%以上呈悬浮死细胞.&nbsp;    各组细胞按下式（国家标准）计算细胞相对增殖度（RGR）:
　　按国家标准，细胞相对增殖度分为6级：>100%为0级；75%~100%为I级；50%~74%为II级；30%~49%为III级；15%~29%为IV级；0~14%为V级. 只有细胞毒性为I级或0级的生物材料才能用于体内实验.
　　1.2.2皮肤致敏试验选用18只健康白色豚鼠，体质量250~450 g，雌雄各半，随机分成实验组、溶剂组及阳性对照组，每组6只，实验前各组各鼠背部去毛，3组动物分别在脱毛区分别涂敷0.1 mL浸出液，10 mL/L冰醋酸溶液及5 mL/L 2.4二硝基氯苯，并于其后7 d，14 d重复涂敷上述溶液0.1 mL，28 d再将各鼠原试验区对侧脱毛后，涂敷上述各溶液0.1 mL，连续观察3 d，记录各鼠试验区皮肤组织反应，包括红斑、水肿、水泡、坏死. 皮肤致敏反应评分按Tab 1标准进行.
　　皮肤反应按标准评分后，根据试验组与对照组豚鼠皮肤反应的差别，按如下标准评价皮肤刺激性: 平均分数0.00~0.49, 无刺激；0.50~2.99, 轻微刺激；3.00~5.99, 中等刺激；6.00~8.00, 严重刺激.表1皮肤致敏反应评分标准（略）
　　1.2.3皮肤刺激试验［4］（皮内注射试验）选成年家兔6只，体质量3.1~4 kg，随机分为2组，剪除兔背部毛，于脊柱两侧确定两块5 cm×5 cm实验区，每区选5个点，各点间距2 cm. 第1组在兔脊柱右侧实验区每点皮内注射明胶/壳聚糖膜花生油浸出液0.2 mL， 左侧每点皮内注射花生油0.2 mL. 第2组则于右侧注射生理盐水浸出液0.2 mL，左侧注射生理盐水0.2 mL. 于注射后15 min，1 h，2 d，3 d观察实验区皮肤反应.
　　1.2.4溶血试验取新鲜抗凝兔血用生理盐水稀释成20 mL/L兔血悬液，将材料浸提液、 生理盐水（阴性对照组）和双蒸水（阳性对照组）各2 mL，明胶/壳聚糖膜样品2 g分别加入20 mL/L兔血悬液2 mL（样品组另外生理盐水2 mL），每组各5份，各试管轻轻摇匀后置37℃水浴1 h，观察各组各管内有无细胞黏集现象出现. 随后1000 r/min离心、沉淀5 min. 取各管上清液1 mL，加入1 g/L Na2CO3溶液4 mL，在722型分光光度计于540 nm处测定各样本吸光度（A）. 计算溶血率:
溶血率=A样品-A阴性对照〖〗A阳性对照-A阴性对照×100%
1.2.5微核试验［3］取健康雄性小鼠30只，体质量20~24 g，随机分成3组：① 材料浸提液组(50 mL/kg)；② 生理盐水阴性对照组(50 mL/kg)；③ 环磷酰胺阳性对照组(50 mg/kg). 在处死动物前30 h和6 h各经尾静脉给药1次，处死动物，取一侧股骨将股骨头剪掉，用小型止血钳夹紧离断，加压将骨髓挤出. 涂于事先加有1滴小牛血清的载玻片上，混匀后推片，晾干，甲醇固定5~10 min，干燥后置于Giemsa应用染液中（磷酸缓冲液9份和Giemsa液1份混匀即成），染色10~20 min，用自来水冲洗玻片，再用蒸馏水冲洗后凉干. 高倍镜下观察每只小鼠的1000个嗜多染红细胞，计算微核出现的个数，各组的均值以千分率表示.
微核率=微核细胞个数〖〗计数细胞个数×1000׉
　　统计学处理：计数资料用χ2检验.
　　2结果
　　2.1细胞毒性试验每组细胞分别在1，2，4，7 d观察细胞形态.  实验组和阴性对照组细胞形态正常，贴壁生长良好，呈棱形或不规则三角形，符合无毒的标准. 阳性对照组的细胞形态基本不贴壁，绝大多数呈浮死细胞. 明胶/壳聚糖膜组L929细胞的相对增殖度在1 d为81.22%，其余均在90%以上(Tab 2). 说明明胶/壳聚糖膜对细胞无毒性反应，符合国家规定的标准.表2各组细胞浓度平均值和相对增殖度（略）
　　2.2皮肤致敏试验各观察时间点，实验组和溶剂对照组豚鼠背部皮肤无任何反应，而阳性对照组均出现不同程度的红肿和皮下硬结. 按照上述“1.2.2”项的皮肤致敏试验评分标准和皮肤刺激性强度评价标准，各不同时间点豚鼠致敏率如Tab 3所示： 实验组和阴性对照组在观察时间点均未见皮肤过敏反应，而阳性对照组在48 h内100%可见皮肤过敏反应征，72 h后消失. 表明该明胶/壳聚糖膜不引起皮肤过敏反应.表3材料浸提液对豚鼠皮肤过敏反应影响（略）
　　2.3皮内注射实验各组实验动物各注射点，除注射后15 min有轻度水肿外，在0~72 h内各点局部均无红斑、水肿反应. 确定明胶/壳聚糖膜无皮肤刺激反应,符合国家规定的标准.
　　2.4溶血实验取新鲜抗凝兔血，以生理盐水作阴性对照，以蒸馏水作阳性对照. 样品溶血率为62%，浸提液溶血率为83%. 生理盐水组，膜样品组，膜浸提液组，双蒸水组的吸光度值（x±s）分别为0.017±0.003，0.020±0.002，0.021±0.004，0.499±0.014.     除阳性对照组外，各组溶血率均在1%以内，符合规定不大于5%的标准. 证明明胶/壳聚糖膜溶血试验阴性，无溶血反应，符合国家规定的标准.
　　2.5微核试验不同试剂给药后小鼠骨髓细胞的微核率见Tab 4： 材料浸提液组与生理盐水对照组比较无显著性差异（χ2=0.067，P=0.7961），材料浸提液组与阳性对照组比较有显著性差异(χ2=79.226,P<0.0001). 表明明胶/壳聚糖膜无溶血反应，符合国家规定的标准.表4不同试剂给药后小鼠骨髓细胞的微核率（略）
　　3讨论
　　壳聚糖是甲壳素脱乙酰基衍生物,是一种天然的聚阳离子多糖,具有生物相容性好以及可生物降解等优点, 还可通过早期诱导胶原合成而抑制创面收缩［5］，近年来已成为医药化工等行业研究热点. 但其成膜后降解时间较长,为了缩短降解时间,我们采用与易降解的生物材料明胶混合制膜的方法,研制了明胶/ 壳聚糖创面敷料［1］. 明胶是动物胶原经温和断裂后的产物,主要成分是胶原、少量的蛋白多糖及某些有机成份. 选择两种材料复合,利用各自优点,探索开发出一种适合于皮肤创伤敷贴的外科使用膜材；明胶和壳聚糖均具有良好的成膜性和黏度，具有良好的透气率和吸胀性,这对于膜吸收伤口渗出液和创面保湿非常有利. 通过上述实验结果可见，我们研制的明胶/壳聚糖生物膜不含致热原、致敏原，无皮肤刺激反应，不引起皮肤过敏反应，无溶血反应，具有良好的生物安全性，可望应用于临床.
　　【参考文献】
　　［1］ 黄治林，姜广建，郭万厚，等. 透明型明胶/壳聚糖烧伤创面敷料的研制. 中华烧伤杂志［J］，2004;20(4):239-240.
　　Huang ZL, Jiang GJ, Guo WH, et al. Manufacture of a kind of transparent gelatin/chitosan wound dressing［J］. Chin J Burns,2004;20(4):239-240.
　　［2］ 奚廷斐. 生物材料和医用装置生物学评价［J］. 生物医学工程与临床, 1998;2(3):131-135.
　　Xi TF. Biological evaluation of biomaterials and medical apparatus［J］. Biomed Engin Clin Sci, 1998;2(3):131-135.
　　［3］ 梁卫东. 细胞培养法评价生物材料相容性研究进展［J］. 生物医学工程杂志，1999; 16(1):86-90.
　　Liang WD. Progress on biocompatibilities of biomaterials through method of cell culture［J］. J Biomed Engin, 1999;16(1):86-90.
　　［4］ 袁伯俊,王治乔. 新药临床前安全性评价与实践［M］. 北京: 军事医学科学出版社,1997:78-80.
　　［5］ Kojima K, Okamoto Y, Kojima K, et al. Effects of chitin and chitosan on collagen synthesis in wound healing［J］. J Vet Med Sci, 2004;66(12):1595-1598
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