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| 抗Stat3多克隆抗体的制备和其在乳腺癌诊断中的应用 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-3  |
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【关键词】 信号转导与转录激活因子3；抗体；乳腺肿瘤；组织学分级 Preparation of polyclonal antibody against Stat3 and its application in the diagnosis of breast cancer 【Abstract】 AIM: To prepare rabbit antibody against Stat3 and analyze its application in the diagnosis of breast cancer. METHODS: The male rabbits were immunized with recombinant mouse Stat3 protein to prepare antibody against Stat3. The purity and specificity of the antibody were analyzed by Western Blot. The expression of Stat3 protein in the 65 cases of breast cancer and 30 cases of normal breast tissue was detected by immunohistochemical staining. RESULTS: The titer of antiStat3 antibody in serum was >1∶256 000 (A450=0.40) at the 6th week after the immunization. Both SDSPAGE and Western Blot analysis showed that there was an obvious protein band with Mr 92 000, The intracytoplasmic expression levels of Stat3 protein in the different histological gradings of 65 cases of breast cancer showed significant difference (P<0.05), so did the intranuclear expression levels (P<0.05) . CONCLUSION: Polyclonal antibody against Stat3 with high titer and specificity can be prepared successfully, and it can be used to detect the expression of Stat3 protein in breast cancer tissue. 【Keywords】 Stat3; antibodies; breast neoplasms; histological grading 【摘要】 目的： 制备兔抗信号转导与转录激活因子3（Stat3）抗体，分析其在乳腺癌诊断中的价值. 方法： 应用人工重组小鼠Stat3蛋白，免疫雄性家兔制备抗Stat3抗体；用免疫印迹法分析检测抗Stat3抗体的纯度和特异性；应用免疫组化染色法检测65例乳腺癌和30例正常乳腺组织中Stat3蛋白的表达. 结果： 用Stat3蛋白免疫家兔被免疫6 wk后，其血清中抗Stat3抗体效价>1∶256,000（A450 nm=0.40）；SDSPAGE和免疫印迹分析均在分子质量（Mr）92 000处有明显的带；65例乳腺癌组织的细胞浆和细胞核中，Stat3蛋白表达量在不同的组织学分级之间有统计学差异(P<0.05). 结论： 高效价和特异性强的抗Stat3抗体被成功制备. 该抗体可用于乳腺癌组织细胞Stat3蛋白表达的检测. 【关键词】 信号转导与转录激活因子3；抗体；乳腺肿瘤；组织学分级 0引言 信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription; Stat3)是一类脱氧核糖核酸结合蛋白，于细胞浆内有少量表达，细胞核内无表达，是信号转导与转录激活因子家族的重要成员之一. 异常的信号转导使Stat3磷酸化而被持续激活，促进细胞的恶性转化［1］和阻断细胞凋亡［2］. Stat3也可以被多种细胞因子、生长因子、非受体酪氨酸激酶、G蛋白等分子激活，将细胞外信号转导至细胞核，激活基因的转录和表达［3］. Stat3表达的变化与肿瘤的发生密切相关，然而，有关Stat3在乳腺癌诊断中的作用还没有详细报道. 我们用本室制备的小鼠重组Stat3蛋白，再制备兔抗Stat3抗体，来分析Stat3蛋白在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达，以及在乳腺癌诊断中的价值. 1材料和方法 1.1材料雄性，新西兰兔，体质量3.0 kg(河北医科大学动物中心). 福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂为美国Gibco RBL产品. HRP标记的羊抗兔IgG和免疫组化显色试剂盒（购自北京中山生物工程公司）. 重组小鼠Stat3蛋白由本室和美国MD公司共同制备（蛋白含量1.63 g/L，经SDSPAGE分离显示单一条带，Mr为92000）. 30例正常乳腺组织来自良性增生和良性腺病的患者，65例乳腺癌组织来自女性乳腺癌患者，年龄(48±15)岁. 这些研究对象经冰冻切片和免疫组化同时证实确诊，病理学分级由病理科提供，常规方法做病理切片. 1.2方法 1.2.1免疫动物将Stat3蛋白（0.336 g/L）0.2 mL与福氏完全佐剂0.5 mL混匀后，注射于家兔腹股沟和后脚掌进行初次免疫. 14 d将同样量的Stat3蛋白与福氏不完全佐剂0.5 mL混匀后进行第二次免疫，注射部位同前. 28 d取Stat3蛋白（0.25 g/L）0.15 mL用福氏不完全佐剂0.5 mL混匀后，于背部皮下多点注射进行最终免疫. 42 d处死兔子收集全血. 其中于初次免疫前取耳静脉血2 mL；第1次免疫后12 d，第2次免疫后7 d，第3次免疫后9, 14 d分别抽血3 mL用于抗体效价测定. 1.2.2抗体效价的检测用0.05 mol/L pH 9.5 CBS稀释Stat3蛋白，用常规方法包被酶标板，ELISA法检测兔血清中抗Stat3抗体的效价. 1.2.3抗体的纯化用330 g/L饱和硫酸胺盐析抗血清，离心沉淀后，用生理盐水透析24 h，8 h换1次生理盐水，将透析液用DEAE32层析柱进行浓缩，收集洗脱液，测A280 nm值. 1.2.4抗体纯度和特异性检测将Stat3蛋白进行SDSPAGE分离（分离胶浓度为120 g/L）. 电泳后，用考马斯亮蓝R250染液染色确认蛋白条带，将分离胶中的蛋白用电泳转移法转移至PVDF膜，PVDF膜用50 g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜. 洗膜后，与兔抗Stat3抗血清(1∶1000稀释)37℃反应2 h；加入HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5000稀释)，于37℃反应1 h，以DAB显色. 1.2.5乳腺组织细胞Stat3表达的检测200309/200403取本院外科65例乳腺癌患者手术切除的乳腺癌组织标本，30例良性增生和良性腺病的乳腺组织进行组织切片. 将上述方法制备的兔抗Stat3抗体用PBS做1∶400稀释，按常规SP方法进行乳腺组织免疫组化染色. 结果判断标准：按照Laird标准［4］进行，Stat3阳性表达为细胞质呈棕黄色云雾状，细胞核呈棕色颗粒状. 每个视野中阳性细胞>50 %为强阳性（），5%～50 %的为阳性（+），<5 %为阴性（-）. Stat3蛋白胞质表达：细胞质呈深棕色云雾状>80%（），细胞质呈棕色云雾状>50 %（），细胞质呈棕黄色云雾状>5%～50 %（+），细胞质呈淡棕黄色云雾状<5 %（-）. Stat3蛋白胞核表达：细胞核呈深棕色颗粒状>80%（），细胞核呈棕色颗粒状>50 %（），细胞核呈棕黄色颗粒状>5%～50 %（+），细胞核不染色或呈淡棕黄色颗粒状<5 %（-）. 统计学处理： 免疫组化染色所得结果用SPSS 11.5软件分析，统计方法为非参数秩和检验，Spearmans等级相关. P<0.05为有统计学意义. 2结果 2.1兔抗Stat3血清效价基础免疫后2, 3, 5, 6 wk分别采取静脉血，间接ELISA法检测抗Stat3抗体的血清效价，分别为1∶6400, 1∶32000, 1∶240000和>1∶256000(A450 nm=0.40). 2.2抗Stat3抗体的特异性和纯度鉴定Stat3蛋白经SDSPAGE分离，用考马斯亮蓝R250染液染色，分离出1条Mr为92 000的蛋白条带，大小与Stat3理论值相符（图1中M和1）. 将凝胶中的Stat3转移至PVDF膜，用制备好兔抗Stat3抗体进行免疫印迹，也出现Mr为92 000左右的带（图1中2），证明此抗体为抗Stat3的特异性抗体. M: marker; 1: Stat3蛋白考马斯亮蓝R250染色；2： Stat3蛋白免疫印迹. 图1兔抗Stat3血清特异性的免疫印迹分析（略） 2.3抗Stat3抗体在乳腺癌诊断中的应用将正常乳腺组织30例和乳腺癌组织65例组织切片进行抗Stat3抗体免疫组化染色（表1，图2）， Stat3在正常乳腺组织细胞质中呈淡棕黄色云雾状，胞核不着色. 乳腺癌组织在不同组织学分级的细胞质中Stat3蛋白表达量有统计学差异 (P<0.05)；细胞核中Stat3蛋白表达在不同组织学分级乳腺癌组织中也有统计学差异(P<0.05).正常乳腺组织细胞质中可见棕黄色雾状着色，胞核不着色（图3A）；在低分化癌细胞质呈棕色云雾状，胞核呈颗粒状深棕色（图3B）；而高分化癌组织的细胞质呈棕黄色云雾状，胞核着色呈棕色颗粒状（图3C）. 表1不同组织学分级的乳腺癌组织中Stat3的表达（略） 图2Stat3蛋白在乳腺癌细胞质（A）和细胞核（B）中的表达量与组织学分级（略） A：正常乳腺组织；B：Ⅲ级；C：Ⅱ级. 图3Stat3在不同分级乳腺癌组织中表达SP ×400（略） 3讨论 Stat3分子由750～795个氨基酸组成，Mr约为92 000. 编码Stat3的基因在鼠科动物定位于第11号染色体，在人类定位于第17号染色体q21. Stat3在信号转导与转录激活途径中发挥着重要作用，细胞膜上的细胞因子受体及非细胞因子受体与相应配体相结合后，使胞质内的Jauns激酶（Jauns Kinase; JAK）处于适当空间位置而相互磷酸化，然后募集Stat3蛋白到胞质区磷酸化激酶的酪氨酸残基上，以激活该蛋白，活化的Stat3形成同源或异源二聚体迅速转位进入细胞核，与其特异的DNA序列结合，启动下游基因的转录［5］. Stat3持续活化可引起急性髓细胞性白血病、磷状细胞癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞异常增生［6-8］. 细胞核内Stat3含量的高低标志着该细胞JAkStat途径的持续激活程度，只有激活的Stat3才能从细胞质转入细胞核，参与基因的表达调控［9］. Berclaz等［10］报道，正常人乳腺上皮细胞、肌上皮细胞、纤维母细胞周围的脂肪性乳腺间质等组织，检测到细胞质有微量Stat3的表达；在乳腺癌组织胞质内和胞核，都有非常强的Stat3表达，比正常乳腺组织高出很多倍. 信号转导与转录激活可使下游癌基因获得转录活性并表达，最终有可能形成癌症. 因此，信号转导与转录激活是疾病（如肿瘤）形成的一个早期事件，Stat3的激活可能发生在疾病进程的早期，检测Stat3蛋白在细胞质、细胞核中的表达量将可能用于乳腺癌的诊断. 本实验结果显示，乳腺癌组织的细胞质Stat3蛋白表达量与组织学分级成正相关，在不同组织学分级的细胞质中Stat3蛋白表达量有显著性差异 (P<0.05). 乳腺癌组织的细胞核中Stat3蛋白表达量与组织学分级成正相关，Stat3蛋白表达的含量也与组织学分级有显著性差异(P<0.001)，组织学分级越高，细胞分化程度越低，胞核Stat3量越高. 当乳腺癌发生时，Stat3的胞浆表达量增高，而胞核Stat3的含量从无到有，即胞核中Stat3蛋白呈阳性，因此Stat3蛋白的过量表达可能在乳腺癌的发生、发展过程中起重要作用. 【参考文献】 ［1］ Bromberg JF, Wrzeszczynska MH, Devgan G, et al. Stat3 as an oncogene［J］. Cell, 1999, 98(3): 295-303. ［2］ Catlett FR, Landowski TH, Oshiro MM, et al. Constitutive activation of Stat3 signaling confers resistance to apoptosis in human U266 myeloma cells［J］. Immunity, 1999,10(1):105-115. ［3］ Takeda K, Akira S. STAT family of transcription factors in cytokinemediated biological responses［J］. Cytokine Growth Factor Rev, 2000,11(3):199-207. ［4］ Laird DW, Fistouris P, Batist G, et al. Deficiency of connexin 43 gap junctions is an independent marker for breast tumors［J］. Cancer Res, 1999, 59(16): 4104-4110. ［5］ Hoey T, Grusby MJ. STATs as mediators of cytokineinduced responses［J］. Adv Immunol, 1999,71:145-162. ［6］ Spiekermann K, Biethahn S, Wilde S, et al. Constitutive activation of STAT transcription factors in acute myelogenous leukemia［J］. Eur J Haematol, 2001,67(2): 63-71. ［7］ Grandis JR, Drenning SD, Zeng Q, et al. Constitutive activation of Stat3 signaling abrogates apoptosis in squamous cell carcinogenesis in vivo［J］. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(8): 4227-4232. ［8］ Garcia R, Bowman TL, Niu G, et al. Constitutive activation of Stat3 by the Src and JAK tyrosine kinases participates in growth regulation of human breast carcinoma cells［J］. Oncogene, 2001,20 (20): 2499-2513. ［9］ Zhong Z, wen Z, Darnell JE. Stat3: A STAT family member activated by tyrosine phosphorylation in response to epidermal growth factor and interleukin6［J］. Science, 1994, 264(5155): 95-98. ［10］ Berclaz G, Altermatt HJ, Rohrbach V, et al. EGFR dependent expression of STAT3 (but not STAT1) in breast cancer［J］. Int J Oncol, 2001, 19(6): 1155-1160 |
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