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| 大青叶中靛玉红的超临界萃取工艺及含量测定 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-3  |
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SFE technology of indirubin from Daqingye and content determination of indirubin 【Abstract】 AIM: To use HPLC for the content determination of indirubin in supercritical fluid extraction (SFE) material from Daqingye and to optimize the process of SFE. METHODS: Content of indirubin was used as index to evaluate the technologies based on orthogonal design, in which 4 factors considered were extraction temperature and pressure, separation temperature and pressure. A HPLC system was used to determine the content of indirubin. RESULTS: Optimal program was as follows: extraction temperature 50℃ and pressure 40 MPa, separation temperature 40℃ and pressure 8 MPa. The average recovery of indirubin was 102.8% and RSD was 1.48%. CONCLUSION: The extraction temperature, extraction pressure and separation pressure all have significant effects on the extraction rate of indirubin. The HPLC method is simple, precise and suitable for the content determination of indirubin in SFE material of Daqingye. 【Keywords】 Daqingye; SFECO2; indirubin; chromatography, high pressure liquid 【摘要】 目的： 建立用HPLC测定大青叶的超临界萃取物中靛玉红含量的方法，对萃取工艺进行优选. 方法： 采用超临界萃取法进行L9(34)正交实验. 以靛玉红含量考察萃取温度、萃取压力、分离温度及分离压力四个因素的影响. 采用HPLC法测定萃取物中靛玉红含量. 结果： 最佳萃取工艺为萃取温度50℃,萃取压力40 MPa,分离温度40℃及分离压力8 MPa. 靛玉红平均回收率为102.8%，RSD为1.48%. 结论： 萃取温度、萃取压力及分离压力对大青叶中靛玉红的萃取都有显著影响. HPLC法操作简便，结果准确，可作为超临界萃取大青叶中靛玉红的质量控制方法. 【关键词】 大青叶；CO2超临界萃取；靛玉红；色谱法，高压液相 0引言 靛玉红主要来源于植物马蓝(Baphicacanthus cusia)、蓼蓝(Polygonum tinctorium)及菘蓝(Isatis indigotica)的中药材如大青叶、板蓝根、青黛等，靛玉红是其主要有效成分. 靛玉红有治疗慢性髓性白血病作用，是一种应用前景广阔的抗肿瘤成分［1］. 靛玉红在中药材中含量很低，为减少药物使用量，提高生物利用度，我们用超临界流体萃取（SFE）法对大青叶中的靛玉红进行分离提纯，同时建立萃取物中靛玉红含量的HPLC测定方法，优化靛玉红SFE工艺. 1材料和方法 1.1材料Golden System高效液相色谱仪（美国Beckman公司），配125型高压双泵，168型二极管阵列检测器；色谱柱: Synersi FusionRP柱（4.6 mm×250 mm， 4 μm，美国Phenomenex公司）；FY2215006超临界萃取仪（南通市飞宇石油科技开发有限公司）；R200D电子分析天平（德国Satorius公司）；旋转蒸发仪（EYELA ASPIRATOR A3S RIKAKIKAT CO.LTD）. 大青叶购自西安药材市场，按照中国药典（2005年版）有关大青叶项下鉴定本品为合格药材；靛玉红对照品购自中国药品生物制品检定所，批号717200204；甲醇为HPLC级（美国FISHER公司），水为超纯水，其余试剂均为AR级. 1.2方法 1.2.1SFE正交实验设计采用L9(34)设计，选择萃取温度、萃取压力、分离温度及分离压力四个因素，每个因素取3水平. 分别为萃取温度40, 50及60℃；萃取压力20, 30及40 MPa；分离温度30, 40及50℃；分离压力8, 10及12 MPa. 1.2.2供试品溶液的制备打开超临界萃取仪，按1.2.1的设计设置萃取仪温度参数，预热完毕后将精密称取的大青叶50 g放入萃取缸Ⅱ，按1.2.1的设计将压力值调整到需要的参数，同时向副泵系统下的夹带剂缸中加入氯仿100 mL，开动副泵，开始萃取. 每半小时收集一次分离液，至2 h内连续收集不到液体时停止该次实验. 将收集到的分离液在旋转蒸发仪上蒸干，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，作为供试品溶液. 1.2.3色谱条件以甲醇 0.015 mol/L醋酸铵（72∶28）（用醋酸以1∶150的比例调节pH值）为流动相；流速为1.0 mL/min；检测器灵敏度： 1.0 AUFS；柱温20℃；检测波长289 nm. 理论板数按靛玉红峰计算不低于4000. 对照品及样品色谱图不同(图1,2). 图1靛玉红对照品的色谱图（略） 图2样品色谱图（略） 1.2.4线性考察精密称取靛玉红对照品10 mg，用甲醇定容于50 mL容量瓶中，超声5 min，制成0.2 g/L的对照品溶液，分别精密吸取该对照品溶液3, 2, 1, 0.5及0.2 mL于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度. 各取以上5个对照品溶液20 μL进样于HPLC系统中，以色谱峰面积对靛玉红进样浓度作线性回归，得回归方程Y=10.83427+0.68547X, r=0.9994. 靛玉红在8~120 mg/L内，线性关系良好. 1.2.5精密度测定取线性关系中同一对照品液连续进样5次，每次20 μL，靛玉红峰面积RSD为1.74%. 1.2.6稳定性实验将同一供试品液在0, 1, 2, 4, 12 h各进样一次测试峰面积，结果RSD为2.65%，表明样品溶液在12 h内稳定. 1.2.7重复性实验取同一供试品液5份，依法测定，结果靛玉红平均含量为17.33 μg/g，RSD为2.07%. 1.2.8加样回收率实验精密量取已知含量的同一供试品液3份，每份1 mL，分别精密加入0.4 mL浓度为0.04 g/L的对照品溶液，按样品含量测定方法操作，平均回收率为102.8%, RSD为1.48%. 1.2.9样品测定精密吸取上述正交实验提取的供试品溶液各20 μL进样,按1.2.3色谱条件进行测定. 2结果 外标法计算靛玉红含量（表1），并计算每个因素每水平的靛玉红含量（表2）. 表1不同工艺的靛玉红含量（略） 表2每个因素每水平的靛玉红含量（略） K值为每因素每水平的三个值之和，如K1为每因素水平为1时的三个值的和，余同. R为级差，即K1, K2和K3三个值中最大值与最小值之差. 对实验数据进行方差分析，结果萃取温度、萃取压力及分离压力对靛玉红的回收率均有显著影响（P<0.05）. 将级差R值依大小排列，则影响靛玉红含量的四因素主次顺序为萃取温度>萃取压力>分离压力>分离温度. 以每个因素每水平的K值中的最大值得知：最佳工艺为萃取温度50℃、萃取压力40 MPa、分离温度40℃及分离压力8 MPa. 按最佳工艺条件萃取了三份大青叶（50 g）进行验证试验，结果靛玉红平均含量为21.87 μg/g，表明该工艺稳定，测定值在较高范围. 3讨论 3.1萃取实验条件的选择在设计正交实验时，为更准确地定位萃取温度的水平范围，在SFE的预实验中做过萃取温度最高60℃和最低30℃（其他条件固定不变）的靛玉红回收率比较，结果发现高温萃取回收率较高，故在正交设计中舍去萃取温度30℃这个水平. 另三个因素的水平设定是依据仪器的工作参数而定的. 在选择夹带剂时曾做过氯仿和甲醇的比较，因为靛玉红在冷甲醇中易析出，故本实验选择氯仿为萃取夹带剂. 在预实验中考虑了萃取时间和CO2流量的影响，结果不同的实验条件下，分离液的流出没有固定的时间规律，萃取仪CO2流量在2 L/h左右,不可调节, 故未将萃取时间和CO2流量两因素纳入正交实验设计中. 3.2HPLC条件的选择靛玉红在242, 292, 362, 544 nm处有吸收［2］，而本实验中靛玉红的紫外最大吸收波长为289 nm. 实验曾用乙腈与水配比作流动相，在反相色谱中用有机碱三乙胺调节峰形，结果效果不理想. 最后用甲醇比水加入醋酸铵，用酸适当调整pH值，所得结果峰形理想，分离效果好. 曾直接以氯仿作溶剂进样，结果氯仿有较强的吸收峰，改为甲醇作溶剂后得以改善. 查阅文献未见类似有关大青叶中靛玉红SFE工艺的报道. 而大青叶中含有的其他活性成分［3］是否被萃取出来，其含量如何，则有待进一步研究. 【参考文献】 ［1］ 唐俐，段积华. 靛玉红及其衍生物的研究［J］. 重庆医科大学学报,2000,25(2):219-221. ［2］ 李彬,郑国平. 高效液相色谱法测定锡类散中靛玉红的含量［J］. 药物鉴定,2004,13(5):39-40. ［3］ 陈海红，孙建宇. 大青叶的研究进展［J］. 中国药业，2004,13(8):79-80 |
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