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| 氨基水杨酸对三硝基苯磺酸诱导的大鼠结肠炎模型的影响 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-3  |
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【关键词】 结肠炎；三硝基苯磺酸；白细胞介素 【Abstract】 AIM: To investigate the effect of 4aminosalicylic acid (4ASA) on trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) induced colitis in rats and to clarify the related mechanism. METHODS: Colitis was induced in female SD rats by rectal administration of TNBS resolved in ethanol. The colitis rats were treated with 4ASANa with doses of 100 and 200 mg/kg respectively for 2 weeks. 5aminosalicylic acid (5ASA) and normal saline were used as control groups. The colonic inflammation including macroscopic and histological changes and myeloperoxidase (MPO) activity was evaluated. Superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) level in colonic mucosa were detected by biochemical methods. The expressions of interleukin1β (IL1β) and tumor necrosis factorα (TNFα) mRNAs in colonic mucosa were determined by a reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) method. RESULTS: Compared with TNBS control group, the macroscopic and histological scores and MPO activity in 4ASA treated groups were decreased (P<0.05), SOD activity was increased (P<0.05), and the level of MDA in colonic mucosa was reduced significantly (P<0.05). The expressions of IL1β and TNFα mRNAs in colonic mucosa were also decreased significantly (P<0.05). The intracolonic administration with 4ASA had no more therapeutic effect than topical treatment with 5ASA. CONCLUSION: The topical treatment with 4ASA can significantly attenuate the colonic damage in TNBSinduced colitis in rats and it may be related to the antioxidant mechanism and the inhibition of the expression of proinflammatory cytokines including IL1β and TNFα. 【Keywords】 colitis; trinitrobenzenesulfonic acid; interleukin1β; tumor necrosis factorα; superoxide dismutase; malondialdehyde; Paminosalicylic acid 【摘要】 目的： 观察4氨基水杨酸（4ASA）治疗三硝基苯磺酸（TNBS）诱导结肠炎的疗效并探讨其作用机制. 方法： 直肠给予雌性SD大鼠TNBS诱导结肠炎，应用4ASANa（100, 200 mg/kg）对其进行治疗，并以5氨基水杨酸（5ASA）作为阳性对照，分别于1 wk及2 wk后取结肠标本评价炎症程度及指标检测，结肠炎症的评价包括大体形态损伤、组织学变化和髓过氧化物酶（MPO）活性，生化法检测超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）水平，逆转录多聚酶链反应（RTPCR）检测结肠组织白细胞介素（IL）1β和肿瘤坏死因子（TNF）αmRNA表达水平. 结果： 与模型组比较，4ASA低剂量组和高剂量组的大体和组织学评分均降低（P均＜0.05），MPO活性降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05），MDA水平降低（P＜0.05），IL1β和TNFα水平降低（P均＜0.05）. 与5ASA组相比，其疗效无显著性差异. 结论： 4ASA对TNBS诱导的大鼠结肠炎具有良好的疗效，其具有抗氧化作用，可减少IL1β和TNFα的生成，从而减轻症状和结肠炎性损伤. 【关键词】 结肠炎；三硝基苯磺酸；白细胞介素1β；肿瘤坏死因子α；超氧化物歧化酶；丙二醛；P氨基水杨酸 0引言 炎症性肠病(inflammation bowel disease, IBD)是病因不明的肠道炎性疾病，包括两种不同的表现形式，即溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）和Crohn病. 近年来有关IBD的病因和发病机制的研究表明其可能是多因素作用的结果，包括遗传、免疫、感染、精神和环境因素等［1］. 目前治疗IBD的药物主要有柳氮磺氨吡啶（sulfasalazine, SASP）、5氨基水杨酸（5aminosalicylic acid, 5ASA）、糖皮质激素、免疫抑制剂等. 4氨基水杨酸(4aminosalicylic acid, 4ASA，又称对氨基水杨酸，paraaminosalicylic acid, PAS）是5ASA的同分异构体，它作为二线抗结核药物被广泛用于治疗肺结核. 有报道［2-6］，4ASA用于治疗IBD安全、有效，其疗效与5ASA相当，而且患者耐受性较好. 但4ASA治疗IBD一直未在临床上广泛应用，而且其治疗机制不明. 我们通过应用4ASA治疗三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)诱导的实验性结肠炎，观察其治疗效果并探讨其作用机制. 1材料和方法 1.1材料健康成年雌性SD大鼠50只（武汉大学医学院实验动物中心），体质量180～220 g. TNBS，邻联二茴香胺，5ASA和4ASANa（美国Sigma公司）；SOD, MDA检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Trizol Reagent（美国Invitrogen公司）；MMLV逆转录酶（美国Promega公司）；相关引物由北京三博志远生物工程有限公司合成；十六烷基三甲基溴化铵为国产分析纯；752型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）. 1.2方法 1.2.1结肠炎动物模型的制备及分组将大鼠随机分为10组： 正常对照组（A1组和A2组，各5只）、模型组（B1组和B2组，各5只）、4ASA低剂量组（C1组和C2组，各5只）、4ASA高剂量组（D1组和D2组，各5只）和5ASA组（E1组和E2组，各5只）. 各组大鼠在实验前1 d禁食. 第1日，除A1组和A2组给予0.3 mL生理盐水灌肠外，其余各组按照文献［7］的方法建立TNBS结肠炎动物模型，每只大鼠乙醚麻醉后，用输液管从大鼠肛门插入，深度约8 cm达结肠部位，缓慢注入0.3 mL含12.5 mg 2,4,6TNBS的500 mL/L乙醇，复制大鼠TNBS结肠炎模型. 第3日，各组分别给予如下处理，1次/d： A1, A2, B1和B2组给予生理盐水1 mL灌肠；C1组和C2组给予4ASANa 100 mg/kg灌肠；D1组和D2组给予4ASANa 200 mg/kg灌肠；E1组和E2组给予5ASA 100 mg/kg灌肠（将4ASANa或5ASA溶于生理盐水制成灌肠液，每只用量1 mL）. 第10日处死A1, B1, C1, D1和E1组动物，第17日处死A2, B2, C2, D2和E2组动物. 1.2.2结肠炎症的评价每日测体质量，观察腹泻及粪便性状. 20 g/L乌拉坦麻醉后处死大鼠，截取自肛门向上8 cm结肠，沿系膜纵行剪开，冰盐水冲洗干净后称湿质量，按BobinDubigeon等［8］提出的评分标准进行大体评分. 取病变部位结肠组织，40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，按Macpherson等［9］提出的组织学评分标准进行组织学评分. 余下组织液氮速冻后转入-80℃超低温冰箱冻存. 1.2.3髓过氧化物酶（MPO）活性测定取大鼠结肠组织200 mg，加5 g/L十六烷基三甲基溴化铵（HTAB）1 mL，匀浆，冻融3次，14 000 g离心15 min，取上清液0.1 mL，加5 mmol/L磷酸盐缓冲液2.9 mL（pH 6.0，含有0.167 g/L邻联二茴香胺和0.005 g/L H2O2），用紫外可见分光光度计测定5 min内A460 nm变化均值，计算酶活性. 1个酶活性单位定义为25℃时每min使1 μmol H2O2转变成H2O所需的酶量，酶活性表示为每克湿质量组织含有的酶活性单位数. 1.2.4超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）水平检测按试剂盒说明书进行操作. 1.2.5逆转录多聚酶链反应（RTPCR）检测结肠组织IL1β及TNFα mRNA表达① 结肠组织总RNA提取： 按Trizol Reagent说明书进行操作，酶标仪测定RNA浓度. ② 逆转录合成cDNA第1链： 按MMLV逆转录酶说明书进行操作，反应条件： 70℃ 5 min, 37℃ 60 min, 95℃ 10 min. ③ PCR扩增： 取1 μL cDNA加入50 μL PCR反应体系进行扩增. PCR扩增条件： 94℃ 5min；94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 60 s，40个循环；72℃ 7 min. IL1β引物序列： 5′TGA CCC ATG TGA GCT GAA AG3′（上游），5′AAC TAC GTC CCG ACC ATT GC3′（下游），扩增片段367 bp；TNFα引物序列： 5′AAA TGG GCT CCC TCT CAT CA3′（上游），5′AGC CTT GTC CCT TGA AGA GA3′（下游），扩增片段248 bp；βactin引物序列： 5′TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C 3′（上游），5′TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G 3′（下游），扩增片段349 bp. ④ PCR扩增产物： 用15 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，用凝胶成像系统及图像分析软件进行成像及分析. 统计学处理： 结果以x±s表示. 采用SPSS12.0进行ANOVA分析及LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.14ASA对TNBS诱导大鼠结肠炎各炎症指标的影响动物于造模后24 h即出现懒动，进食量减少，解稀便或糊状便，便血，体质量减轻；肛门以上8 cm结肠湿质量增加；肉眼可见肠黏膜充血水肿，糜烂，溃疡形成，肠壁增厚；镜下可见黏膜及黏膜以下淋巴细胞及中性粒细胞浸润. 给予4ASANa(100，200 mg/kg)治疗1 wk后大鼠腹泻及便血停止，大便逐渐成形，体质量回升（P<0.05）；结肠湿质量、大体与组织学损伤评分及MPO活性均降低（P<0.05）；治疗2 wk后，大便成形，体质量回升，结肠湿质量、大体与组织学损伤评分及MPO活性降低更加明显. 与5ASA治疗组比较，体质量增加，结肠湿质量、大体与组织学损伤评分及MPO活性无显著性差异（P<0.05，表1）.表14ASA治疗前后各炎症指标 2.24ASA对TNBS诱导结肠炎大鼠结肠组织SOD活性及MDA水平的影响与正常对照组比较，模型组大鼠结肠组织SOD活性降低，MDA水平升高（P<0.01）；经4ASANa(100，200 mg/kg)治疗1 wk后，SOD活性升高，MDA水平降低（P<0.05）；治疗2 wk后，4ASA对SOD活性和MDA水平的影响更显著（P<0.05，表2）. 5ASA对结肠组织SOD活性及MDA水平的影响与4ASA高、低剂量组类似. 表24ASA对结肠组织SOD活性、MDA水平、IL1β及TNFα mRNA表达的影响 2.34ASA对TNBS诱导结肠炎大鼠结肠组织IL1β及TNFα mRNA表达的影响模型组大鼠结肠组织IL1β及TNFα mRNA表达较正常对照组显著增加（P＜0.01）；用4ASA高、低剂量治疗1 wk后，IL1β及TNFα表达均降低（P＜0.05）；治疗2 wk后IL1β及TNFα表达降低更加明显（P＜0.05，表2，图1）. 5ASA组大鼠结肠组织IL1β及TNFα表达也降低（P＜0.05）. 4ASA高、低剂量组与5ASA组比较，差异无统计学意义. 3讨论 TNBS/乙醇诱发大鼠结肠炎的机制为TNBS作为半抗原与结肠内的自身蛋白结合形成完全抗原，激活黏膜免疫系统，引起一系列免疫应答和炎症反应，其病理表现与人类IBD类似，被广泛用于IBD发病机制研究及IBD治疗药物的筛选和评价［7］. 在TNBS/乙醇诱发结肠炎模型中，炎症部位结肠组织湿重被认为能可靠、敏感地显示炎症应答的严重程度和范围［10］. 我们的实验结果显示，4ASA(100, 200 mg/kg)灌肠治疗1 wk后远端结肠组织湿质量显著降低，治疗2 wk后降低更加显著. 粘连的发生是TNBS结肠炎的特征之一，它是透壁性炎症的结果［7］. 本实验显示4ASA能降低粘连的发生. 在人类IBD和结肠炎动物模型中，中性粒细胞被认为能引起组织损伤和黏膜功能障碍. 当中性粒细胞向腔内移行时，它们释 放大量毒性介质，破坏黏膜屏障. MPO活性是反映中性粒细胞浸润的一个生化指标. 本实验中，4ASA灌肠治疗1 wk能显著降低结肠组织MPO活性，治疗2 wk作用更明显. 同时我们还观察到，4ASA灌肠治疗1 wk及2 wk均能显著降低结肠黏膜大体及组织学评分. 5ASA是治疗IBD的主要药物，而4ASA与5ASA在结构上仅仅一个氨基位置的差别. Campieri等［2］发现4ASA小剂量使用治疗UC与5ASA效果相当；Gandolfo等［3］采用4ASA保留灌肠治疗UC，证实是安全有效的；Ginsberg等［4］报道4ASA口服治疗对SASP不耐受的UC患者有效，而且Schreiber等［5］报道4ASA用于静止期Crohn病维持治疗的疗效与5ASA相当；最近，Daniel等［6］报道对于服用5ASA引起胰腺炎的UC患者，4ASA是一种安全、耐受性好的治疗选择. 我们的研究显示，4ASA（100, 200 mg/kg）治疗组与5ASA治疗组比较，体质量增加、结肠湿质量、大体与组织学损伤评分及MPO活性无显著性差异，与国外临床试验结果一致. 因此，4ASA灌肠可明显减轻结肠炎大鼠结肠损伤程度，缓解结肠炎症状，表现出显著的抗炎作用，其疗效与5ASA相当. 目前关于4ASA是否具有抗氧化作用，存在着两种不同的看法. Nielsen等［11］认为4ASA不是一种有效的自由基清除剂；而Allgayer等［12］认为4ASA在无细胞系统中是一种活性氧清除剂，并可抑制激活的中性粒细胞产生这些物质. 我们观察到，TNBS/乙醇诱导的结肠炎大鼠结肠组织SOD活性降低，MDA水平升高；给予4ASA灌肠治疗1 wk后SOD活性升高，MDA水平降低；2 wk后影响更显著，提示4ASA具有抗氧化作用. IL1β是一个关键的促炎细胞因子，它通过激活免疫细胞级联反应使炎症反应加重. 腹泻是肠道炎症的主要症状，而IL1β似乎是腹泻的主要刺激物［13］. 高剂量IL1β引起上皮细胞坏死、水肿、中性粒细胞浸润和杯状细胞缺失. 抑制内源性IL1β的活性可缓解急性和慢性实验性结肠炎及其全身并发症［14］. TNFα在TNBS诱导的结肠炎的发病机制中发挥重要作用. TNFα是一个具有显著趋化活性的细胞因子，在IL1β的协同作用下，使相关的酶激活（包括一氧化氮合酶、磷脂酶A2、环氧化酶和蛋白酶等），从而诱导黏附分子和其他炎性细胞因子表达，直接或间接导致黏膜损伤［15］. 本研究显示，炎症时大鼠结肠组织IL1β及TNFα mRNA表达较正常对照组显著增加；用4ASA治疗1 wk后，IL1β及TNFα表达均降低，治疗2 wk后IL1β及TNFα表达降低更加明显，提示4ASA可抑制IL1β及TNFα在结肠组织中表达，减轻结肠黏膜损害，改善症状. 【参考文献】 ［1］ Shanahan F. Inflammatory bowel disease: Immunodiagnostics, immunotherapeutics and ecotherapeutics ［J］. Gastroenterology, 2001,120:622-635. ［2］ Campieri M, Lanfranchi GA, Bertoni F, et al. A double blind clinical trial to compare the effects of 4aminosalicylic acid to 5aminosalicylic acid in topical treatment of ulcerative colitis ［J］. Digestion, 1984,29:204-208. ［3］ Gandolfo J, Farthing M, Powers G, et al. 4aminosalicylic acid retention enemas in treatment of distal colitis ［J］. Dig Dis Sci, 1987,32:700-704. ［4］ Ginsberg AL, Davis ND, Nochomovitz LE. Placebocontrolled trial of ulcerative colitis with oral 4aminosalicylic acid ［J］. Gastroentorology, 1992,102:448-452. ［5］ Schreiber S, Howaldt S, Raedler A. Oral 4aminosalicylic acid versus 5aminosalicylic acid slow release tablets. Double controlled blind pilot study in the maintenance treatment of Crohns ileocolitis［J］. Gut, 1994,35:1081-1085. ［6］ Daniel F, Seksik P, Cacheux W, et al. Tolerance of 4aminosalicylic acid enemas in patients with inflammatory bowel disease and 5aminosalicylicinduced acute pancreatitis［J］. Inflamm Bowel Dis, 2004,10(3):258-260. ［7］ Morris GP, Beck PL, Herridge MS, et al. Hapteninduced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon［J］. Gastroenterology, 1989,96:795-803. ［8］ BobinDubigeon C, Collin X, Grimaud N, et al. Effects of tumor necrosis factorα synthesis inhibitors on rat trinitrobenzene sulphonic acidinduced chronic colitis［J］. Eur J Pharmacol, 2001,42:103-110. ［9］ Macpherson BR, Pfeiffer CJ. Experimental production of diffuse colitis in rats［J］. Digestion, 1978,17(2):135-150. ［10］ Rachmilewitz D, Simon PL, Schwartz LW, et al. Inflammatory mediators of experimental colitis in rats［J］. Gastroenterology, 1989,97:326-327. ［11］ Nielsen OH, AhnfeltRonne I. 4Aminosalicylic acid has no effect on arachidonic acid metabolism in human neutrophils or on the free radical 1,1 diphenyl2picrylhydrazyl［J］. Pharmacol Toxicol, 1998,62:233-236. ［12］ Allgayer H, Rang S, Hofer P, et al. Superoxide radical (O2) inhibition by sulfasalazine (SAZ) and aminosalicylates: Extra vs intracellular action［J］. Gastroenterology, 1991, 100: A556. ［13］ Sartor RB. Cytokines in intestinal inflammation: pathophysiological and clinical considerations［J］. Gastroenterology, 1994,106:533-539. ［14］ Rogler G, Andus T. Cytokines in inflammatory bowel disease［J］. World J Surg, 1998,22(4):382389. ［15］ Schreiber S, Nikolaus S, Hampe J, et al. Tumor necrosis factoralpha and interleukin 1beta in relapse of Crohns disease［J］. Lancet, 1999,353:459-461 |
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