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p38 MAPK在嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞释放MCP           ★★★ 【字体：小 大】
p38 MAPK在嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞释放MCP
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-3    
作者：王成彬，童红莉，田亚平,汪德清，黄振国，叶伟基，李洛谊，林伟基
 
【关键词】  上皮细胞
    Regulatory role of p38 MAPK for MCP1 release from activated bronchial epithelial cells by eosinophils
　　【Abstract】  AIM: To investigate the release of monocyte chemoattractant protein （MCP）1 from the coculture of human bronchial epithelial cells and eosinophils and the related mechanisms. METHODS: MCP1 in culture supernatant was determined by Cytometric Bead Array (CBA) Kit in flow cytometry to compare MCP1 release in bronchial epithelial cells and eosinophils cultured alone or together, and investigate the inhibitive effect of SB 203580, a selective  inhibitor of p38 MAPK, on MCP1 release. The reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) was used to analyze the gene expression of MCP1 in bronchial epithelial cells during coculture with eosinophils and the effect of SB 203580. RESULTS: The interaction of eosinophils and bronchial epithelial cells was found to upregulate the gene expression of MCP1 in epithelial cells. MCP1 in coculture supernatant of bronchial epithelial cells and eosinophils was elevated significantly ［(1266±127) ng/L vs (134±25) ng/L,P<0.001］. Fixed eosinophils, which lost the ability to release MCP1, could also elevate  epithelial cells to release MCP1 ［(773±48) ng/L vs (107±15) ng/L, P<0.001］ in coculture. SB 203580 could effectively inhibit MCP1 gene expression of bronchial epithelial cells during coculture with eosinophils, and decreased the release of MCP1 in the coculture of epithelial cells and eosinophils or fixed eosinophils ［(1335±115) ng/L vs (481±42) ng/L, (868±89) ng/L vs (239±26) ng/L, P<0.001］. CONCLUSION: Eosinophils can activate bronchial epithelial cells to express MCP1 in coculture by p38 MAPK pathway so as to regulate the airway inflammatory reaction.
　　【Keywords】 bronchi; epithelial cells; eosinophils; monocyte chemoattractant protein1; p38 MAPK
　　【摘要】　目的： 探讨支气管上皮细胞与嗜酸性粒细胞联合培养过程中炎性介质的释放及其机制. 方法：应用流式细胞微珠实验（CBA）方法定量比较嗜酸性粒细胞、支气管上皮细胞及其联合培养上清液中单核细胞趋化蛋白（MCP）1的释放以及p38 MAPK抑制剂SB 203580干预的影响；用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）分析联合培养过程中嗜酸性粒细胞对支气管上皮细胞MCP1基因表达的活化及SB 203580对MCP1表达的抑制作用. 结果： 经嗜酸性粒细胞活化后，支气管上皮细胞中MCP1基因表达明显上调；嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞联合培养上清液中MCP1蛋白质释放显著增加［(1266±127) ng/L vs (134±25) ng/L, P<0.001］；多聚甲醛固定后的嗜酸性粒细胞不能释放MCP1，但其在与支气管上皮细胞联合培养过程中仍可增加支气管上皮细胞释放MCP1 ［(773±48) ng/L vs (107±15) ng/L, P<0.001］；p38 MAPK抑制剂SB 203580可有效抑制嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞表达MCP1基因，显著降低正常嗜酸性粒细胞和多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞与支气管上皮细胞联合培养过程中MCP1的释放［(1335±115) ng/L vs (481±42) ng/L和(868±89) ng/L vs (239±26) ng/L, P<0.001］. 结论： 嗜酸性粒细胞可通过p38 MAPK信号传导通路活化支气管上皮细胞表达MCP1，调控过敏性气道炎症反应.
 
　　【关键词】支气管；上皮细胞；嗜酸细胞；单核细胞化学吸引蛋白质1；p38 MAPK
　　0引言
　　过敏性哮喘的显著特点就是大量炎性细胞，特别是嗜酸性粒细胞在支气管炎症部位聚积，活化后的嗜酸性粒细胞可通过脱颗粒释放嗜酸性粒细胞阳性蛋白（ECP）、主要碱性蛋白(MBP)等毒性蛋白，而这些毒性蛋白可造成支气管上皮损伤［1］. 损伤的支气管上皮修复和气道重建可导致气道水肿、增厚、狭窄和对不同刺激的反应性增高，从而引发常见的咳嗽、呼吸困难等一系列临床症状. 支管上皮对外环境的屏障功能已被广泛认识，但作为哮喘炎症反应的发生部位，其在过敏性哮喘发生、发展中的免疫调控作用未能引起广泛重视. 我们通过嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞接触培养为实验模型，探讨哮喘过程中嗜酸粒细胞从外周血移行至支气管上皮后，通过活化支气管上皮释放炎性介质细胞趋化因子MCP1，调控过敏性哮喘炎性反应的过程.
　　1材料和方法
　　1.1材料密度1.082 kg/L Percoll溶液: 混合87.92 mL Percoll原液(密度1.130, 瑞典Amersham公司产品)，15 mL 1.5 mol/L NaCl和47.1 mL去离子水；抗CD16抗体磁珠和细胞磁性分离系统（MACS）购自德国Miltenyi Biotec公司；p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）抑制剂SB 203580购自美国Calbiochem 公司；DMEM/F12，RPMI 1640细胞培养液购自美国Gibco Invitrogen公司；RNA抽提试剂TRIReagent购自美国Molecular Research Center公司；人细胞趋化因子CBA测定试剂盒购自美国BD公司；第一条链cDNA合成试剂盒购自瑞典Amersham 公司；MCP1和βactin PCR扩增引物为美国Invitrogen公司产品；流式细胞仪（FACSCalibur）为美国BD 公司产品；DNA热循环仪（PTC200）为美国MJ公司；新鲜人全血由香港红十字会输血服务中心提供.
 
　　1.2方法
　　1.2.1嗜酸性粒细胞分离新鲜人全血中血细胞通过密度为1.082 kg/L Percoll溶液离心分层，去除淋巴细胞层后用冰浴去离子水裂解红细胞，所剩嗜中性、酸性粒细胞与抗CD16抗体磁珠反应使细胞表面带有CD16蛋白质的嗜中性粒细胞与磁珠结合. 当嗜中性、酸性粒细胞混悬液通过磁性分离柱时，由于磁性作用使结合在磁珠上的嗜中性粒细胞吸附于分离柱上，而表面不表达CD16的嗜酸性粒细胞则可以顺利通过分离柱. 分离后的嗜酸性粒细胞用伊红染色鉴定其纯度，计数并调整到适当浓度，再悬浮于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640细胞培养液中待用.
 
　　1.2.2嗜酸性粒细胞固定分离后的嗜酸性粒细胞用10 g/L多聚甲醛在室温中固定3 h，再用含20 mL/L小牛血清的PBS清洗3遍，计数并调整到适当浓度，再悬浮于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640细胞培养液中待用.
 
　　1.2.3细胞培养人支气管上皮细胞系（BEAS2B，美国ATCC公司购买）置含100 mL/L小牛血清的DMEM/F12细胞培养液中，37℃, 50 mL/L CO2孵育.
 
　　1.2.4MCP1释放试验BEAS2B细胞被培养在24孔组织培养板中，待细胞贴壁生长到形成单层后，移净原培养液并立即加入1 mL含1×109/L正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞的（事先加入100 mL/L小牛血清）RPMI 1640细胞培养液，嗜酸性粒细胞与BEAS2B细胞联合培养12 h.
 
　　1.2.5p38 MAPK抑制剂干预实验BEAS2B细胞被培养在24孔组织培养板中，待细胞贴壁生长到形成单层后，弃原培养液并立即加入含100 mL/L 小牛血清的RPMI 1640细胞培养液0.5 mL，然后加入20 μmol/L SB 203580培养1 h，再加入含2×109/L正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞的（事先加入100 mL/L 小牛血清）RPMI 1640细胞培养液0.5 mL. 1×106正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞与BEAS2B细胞在10 μmol/L SB203580存在情况下联合培养12 h.
 
　　1.2.6细胞培养上清液收集正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞与BEAS2B细胞联合培养到实验设计时间后，收集培养上清液，510 g, 4℃离心10 min，分离无细胞上清液并立即置于-80℃保存.

1.2.7细胞趋化因子测定细胞培养上清液中的细胞趋化因子MCP1应用流式细胞微珠实验（CBA）试剂盒定量（美国BD公司产品）［2］.
 
　　1.2.8BEAS2B细胞总RNA抽提融合的BEAS2B细胞与4×106嗜酸性粒细胞在4 mL含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640细胞培养液中联合培养12  h（p38 MAPK抑制剂实验，先加入20 μmol/L SB 203580与BEAS2B细胞培养1 h）. 移去细胞培养液后，BEAS2B细胞用冰育PBS冲洗三次，BEAS2B细胞总RNA用TRIReagent RNA提取试剂盒根据操作说明进行提取. 所提RNA质量通过电泳方法鉴定，分光光度法定量其浓度，于-80℃冰冻保存待用.
 
　　1.2.9RTPCR分析BEAS2B细胞MCP1基因表达细胞总RNA用第一条链cDNA合成试剂反转录到cDNA再行PCR反应. PCR反应混合物为3 mmol/L  MgCl2, 200 μmol/L  dNTPs, 1 单位DNA聚合酶, 50 pmol 5′和3′引物. PCR扩增引物: MCP1 上游5′AATGCCCCAGTCACCTGCTGTTAT3′，下游 5′GCAATTTCCCCAAGTCTCTGTATC3］. 作为p38 MAPK 选择性抑制剂，SB 203580可抑制p38 MAPK对某些炎性介质相关基因转录的调控. 本研究发现，在联合培养体系中加入SB 203580可有效抑制嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞表达MCP1基因，显著减少嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞联合培养上清液中MCP1的释放. 上述研究结果意味着嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞释放MCP1可能通过激活p38 MAPK信号传导途径实现的.
　　【参考文献】
　　［1］ Walsh GM. Eosinophil granule proteins and their role in disease ［J］. Curr Opin Hematol,2001,8:28-33.
　　［2］Sabatini F, Silvestri M, Sale R, et al. Cytokine release and adhesion molecule expression by stimulated human bronchial epithelial cells are downregulated by salmeterol ［J］. Respir Med, 2003,97:1052-1060.
　　［3］ Jordan NJ, Kolios G, Abbot SE, et al. Expression of functional CXCR4 chemokine receptors on human colonic epithelial cells ［J］. J Clin Invest, 1999,104:1061-1069.
　　［4］ Wong CK, Ip WK, Lam CWK. IL3, 5 and GMCSFinduced adhesion molecule expression on eosinophils by p38 MAPK and NFkB ［J］. Am J Respir Cell Mol Biol, 2003,29:133-147.
　　［5］ Dakhama A, Kraft M, Martin RJ, et al. Induction of regulated upon activation,normal T cells expressed and secreted (RANTES) and transforming growth factorbeta 1 in airway epithelial cells by Mycoplasma pneumoniae ［J］. Am J Respir Cell Mol Biol, 2003,29:344-351.
　　［6］ Walsh GM. Eosinophilepithelial cell interactions: A special relationship ［J］?  Clin Exp Allergy, 2001,31:351-354.
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　　［9］ Tokuda M, Miyamoto R, Sakuta T, et al. Substance P activates p38 mitogenactivated protein kinase to promote IL6 induction in human dental pulp fibroblasts ［J］. Connect Tissue Res, 2005,46:153-158.
　　［10］ Hu MC, Wasserman D, Hartwig S, et al. p38MAPK acts in the BMP7dependent stimulatory pathway during epithelial cell morphogenesis and is regulated by Smad1 ［J］. J Biol Chem, 2004,279:12051-12059.
　　［11］ Hashimoto S, Matsumoto K, Gon Y, et al. p38 MAP kinase regulates TNF alpha,IL1 alpha and PAFinduced RANTES and GMCSF production by human bronchial epithelial cells ［J］. Clin Exp Allergy, 2000,30:48-55
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