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Megalin基因片段（3189-4169）的克隆及其表达           ★★★ 【字体：小 大】
Megalin基因片段（3189-4169）的克隆及其表达
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-1    
【关键词】  肾炎
　　【摘要】  目的  大鼠Heymann肾炎（HN）是人类膜性肾病的经典动物模型，其发病机制的研究推动了人们对膜性肾病的理解。Megalin是HN主要致病抗原，也是低密度脂蛋白受体家族成员，其胞外结构形成的4簇配体结合区域均可能存在抗原决定簇。本实验拟克隆其第2簇配体结合区域，并表达融合蛋白，为进一步研究其抗原决定簇的确切位置及其功能打下基础。方法  采用RT-PCR获得大鼠肾目的片段Megalin基因3189-4169，再与原核表达质粒pTrcHis A结合构建重组质粒，然后将重组质粒转入TOP10细菌诱导表达融合蛋白，最后用Western-Blot检测表达的融合蛋白。结果  （1）RT-PCR获得的目的片段大小为1kb，测序证实为Megalin基因3189-4169;测序报告还显示有3个突变，分别位于Megalin基因的3404、3647、3702，其中前两个突变都不影响融合蛋白的氨基酸序列，第3个突变则将赖氨酸变成谷氨酸，经分析对融合蛋白表达无明显影响。（2）构建的重组质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，得到预期的2个片段4.4kb和1kb，分别表示质粒pTrcHis A和Megalin基因3189-4169。（3）用IPTG诱导TOP10（含有重组质粒）融合蛋白表达后，经Western-Blot检测发现了38kD的目的蛋白。阳性对照TOP/CAT在IPTG诱导前没有出现蛋白条带，在IPTG诱导后4h出现蛋白条带；阴性对照TOP10（不含有质粒）和TOP10（含有pTrcHis A）经IPTG诱导后均无目的条带出现。另外，融合蛋白的表达量在IPTG诱导后4~6h增加明显。结论  成功构建了重组表达质粒（带有Megalin基因3189-4169的pTrcHis A）；成功诱导了融合蛋白的表达，为进一步研究Megalin基因抗原决定簇的确切位置及研究Megalin的功能提供了基础。
   
　　【关键词】  肾炎;基因;表位;融合蛋白
　　【Abstract】  Objective  Rat Heymann nephritis（HN）is a classic model of human membranous nephropathy.Research of its pathogenesis help understand the human membranous nephropathy.Megalin is the major antigen of HN,and it is also a member of the low density lipoprotein receptor gene family；its extracellular region can bind multiple ligands,and this extracellular region form four clusters of ligand-binding domains containing pathogenic epitopes.So we cloned the second cluster of ligand binding repeats and express the recombinant proteins containing N-Terminal 6xHis tags.This study was aimed to provide the basis to precisely locate the pathogenic epitope and help understand its function.Methods  We applied reverse transcription PCR to obtain objective band（Megalin gene 3189-4169）,then constructed the recombinant plasmid by inserting this fragment into pTrcHis A.After the recombinant plasmid was transfected into TOP10,the expression of 6xHis fusion protein was induced by isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）.Finally Western-Blot was performed to detect the fusion protein.Results  RT-PCR showed the size of object band wss 1kb.After recombinant plasmid were digested with BamHⅠand EcoRⅠ,we obtained two fragments:one size was 1kb,the other was 4.4kb.Western-Blot showed the fusion protein size was 38kD，and the yield of fusion protein was obviously increased at 4~6 hours by IPTG inducing.Conclusion  We succeed in constructing recombinant plasmid and obtaining the fusion protein,which may provide basis for further study.
　　【Key words】  nephritis;gene;epitope;fusion protein
　　膜性肾病是儿童及成人常见难治性肾脏疾病之一，以上皮下免疫复合物的沉积致肾小球基底膜增厚和蛋白尿为特征；其发病机制尚不清楚，现有对膜性肾病的认识很多来自于其经典动物模型Heymann肾炎（HN）的研究。因此，对Heymann肾炎的分子免疫病理机制的研究将有助于提高对膜性肾病的认识，从而改进治疗。
　　现已明确Megalin（也称gp 330）是HN的主要致病抗原成分，在肾脏主要表达于近端小管的刷状缘和肾小球上皮细胞的胞被小凹中［1,2］。它是一个跨膜糖蛋白，属于低密度脂蛋白受体家族成员，胞外区形成4簇潜在的受体配体结合区域［3］；可与多种配体结合，包括受体相关蛋白（RAP）、血纤维蛋白溶酶原、细胞外基质成分、纤溶酶原激活因子和纤溶酶原激活因子抑制物Ⅰ型复合物、载脂蛋白E富集的β-VLDL、脂蛋白脂肪酶、乳铁转移蛋白以及钙离子、胰岛素等［4~7］。对Heymann肾炎中Megalin可能与RAP结合形成HN抗原复合物，再与循环中的抗体结合形成原位免疫复合物，导致肾小球的损伤和继之的大量蛋白尿［4,8］。
   
　　对Heymann肾炎抗原的研究认为Megalin和RAP上均存在抗原决定簇。RAP上的抗原决定簇定位在N末端的15个氨基酸（39-44氨基酸）［9,10］；国内研究认为RAP C末端的108个氨基酸多肽也可能存在Heymann肾炎病理性表型,而对Megalin的抗原位点的分析因其分子量大，目前尚不清楚。Akihiko Saito等研究发现4簇配体结合重复序列表达蛋白中，仅第2个配体结合区域表达的蛋白能被检测到；确定第2簇配体结合区域中的46个氨基酸（氨基酸1160-1205，也是第5个配体结合重复序列）包含主要的抗原决定簇［11］，第2簇配体结合区域包含的结合位点，可与RAP及其他配体结合，而其他3簇配体结合区域则未见参与［6］。Andrew V.Oleinikov等研究发现Megalin N末端一个60kD的片段（它定位在Megalin基因的第1簇配体结合区和第1个YWTD分隔区域,可能部分或者全部包含在Megalin的180-453氨基酸残基中）可以和Megalin完整的分子一样诱导完全的主动型HN，因此他们认为这个片段包含有T和B抗原决定簇,这个观点与前面的研究不一致［12］。故明确Megalin的确切抗原决定簇将有助于对HN肾炎分子机制的探讨，并最终有助于人类膜性肾病的治疗。
　　1  Megalin基因片段（3189-4169）的获得
　　1.1  材料与试剂  清洁级SD健康成年大鼠（来源于华中科技大学同济医学院实验动物中心）、Trizon试剂（Omega Blotek公司的RNA-Solv Reagent）、氯仿、异丙醇、乙醇、DEPC处理水、手术器械、玻璃匀浆器、Pharmacia Biotech的Gene Quent RNA/DNA Calculator；逆转录酶M-MLV（MBI公司）、Rnasin Ribonuclease Inhibitor（华美生物工程公司）、dNTP（25mM混）； Roche公司的Expand Long Template PCR System、PCR仪（PERKIN ELMER公司的GeneAmp PCR System 9600）。电泳槽、100bpDNA Ladder、lambdaDNA/HindⅢ+ EcoRⅠ Markers、英国UVP公司GOS800型凝胶成像分析系统。实验引物由上海生工生物工程公司合成。P1： “5′-CGT GGA TCC CAG CAG TGT GGC TCC CTC TC  -3′”；5′端有BamHⅠ酶切位点G↓GA TCC，酶切位点后的碱基序列开始于Megalin的3189（Megalin基因序列查自NCBI的GeneBank）。P2： “5′-GCC GGA ATT CGC AAA GTG GGG ACT CGT CAG -3′”；5′端有EcoRⅠ酶切位点G↓AA TTC。凝胶DNA回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒（Omega公司）、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ（TaKaRa公司）、T4 DNA Ligase（TaKaRa公司）、Lambda DNA/HindⅢ＋EcoRⅠ Markers、原核表达质粒 pTrcHis A（Invitrogen公司）、TOP 10菌种（pTrcHis A自带）。一抗6-Histidine（Epitope Tagging）Ab-1（Clone 4D11）鼠单抗（NeoMarkers公司）、二抗为碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG（H+L）（北京中山生物技术有限公司）、NBT/BCIP染色试剂盒（华美生物工程公司）、低分子量标准蛋白质（武汉天源公司）、醋酸纤维膜、电泳仪（BioRad）、电转仪（Biometra）。
　　1.2  实验方法
　　1.2.1  大鼠肾皮质总RNA提取  SD大鼠开腹后，生理盐水灌洗肾脏，剪下肾皮质，留下100mg左右的样品；放入事先干烤过的玻璃匀浆器中，加入1ml Trizon试剂，按试剂说明书提取总RNA，最后测OD值，并计算其浓度，OD260在1.6~2.0示其纯度高；将RNA于-70℃保存。
　　1.2.2  逆转录  总反应体系20μl ；加入5μg RNA，依次加入引物 P2、无RNase水、M-MLV 5×buffer、dNTP、RNAsin、M-MLV，42℃温育60min后，95℃ 5min终止反应，反应产物-20℃保存。
　　1.2.3  PCR  按Roche公司的Expand Long Template PCR System说明书操作。在2个EP管中分别配液，mix 1包括dNTP混、P1＋P2混、逆转录模板DNA，加水至终体积25μl，mix 2包括10×buffer 3、MgCl2、长酶，也是加水至终体积25μl。mix 1、mix 2稍离心混合后，将mix 1加入到mix 2，再稍离心混合；加入30μl矿物油；立即进行PCR循环。循环条件：94℃变性2min后；进行94℃变性10s，63℃退火30s，68℃延伸45s，共10个循环；然后94℃变性10s，63℃退火30s，68℃延伸不同时间，共20个循环，延伸时间从45s开始，每个循环增加20s。最后再68℃延伸7min，4℃结束反应。
　　1.2.4  DNA电泳  常规制胶、点样、电泳、凝胶成像系统观察。
　　1.2.5  DNA回收、酶切和连接  按Omega试剂盒说明书操作。DNA电泳后，切下目的条带后，进行去凝胶，然后上DNA结合柱，最后洗脱下DNA。DNA酶切采用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切体系。DNA的连接用T4DNA连接酶16℃反应过夜（或更长时间）。
　　1.2.6  重组质粒DNA的鉴定  常规细菌培养、保存，感受态细菌制备，质粒的转化用CaCl2法。质粒DNA的提取参照Omega小量提取试剂盒操作。
　　1.2.7  融合蛋白的诱导表达  按Invitrogen公司原核表达质粒pTrcHis A说明书操作。含重组质粒的单菌落TOP 10接种2ml LB Amp+培养基，过夜培养；第二天将过夜的菌液0.3ml接种到50ml LB培养基中（Amp+），37℃ 300r/min剧烈振摇3h取1ml菌液，离心后去上清，沉淀放在-20℃保存，标记为0点样本。再加入IPTG（终浓度为1mM），继续剧烈振摇。每隔1h取一次样本，取6次；同样离心菌液，沉淀保存-20℃，分别标记为1h样本、2h样本等。所有时间点的样本收集完后，用100μl PBS重悬沉淀；液氮冷冻、42℃水浴融解，反复冻溶数次；再用低温离心机以最大速度离心10min。分装上清和沉淀，与蛋白电泳上样缓冲液混合后电泳；考马斯亮蓝染色，寻找强度增加的期望分子量大小的蛋白条带；并与阳性和阴性对照比较。
　　1.2.8  Western-Blot蛋白印迹检测目的融合蛋白的表达  将诱导表达的融合蛋白（样品沉淀）与上样缓冲液混合后电泳，10mA 30min，接着25mA 90~120min。取下凝胶，与膜、滤纸叠成三明治结构，用夹子夹好，300mA电转70min。取下膜，用封闭液（TBST+5%的脱脂奶粉）封闭1~2h，TBST洗膜，10min 4次；一抗稀释的封闭液（1∶500）封闭膜，4℃过夜；TBST洗膜，10min 4次；二抗稀释的封闭液（1∶500）封闭膜1~2h；TBST洗膜，10min 4次；最后NBT＋BCIP显色，凝胶成像系统拍照分析。
　　2  重组表达质粒（带有Megalin基因片段3189-4169的pTrcHis A）的构建
　　pTrcHis A是带有N末端6×His（6个组氨酸）的可在E.coli（大肠杆菌）高效表达和纯化重组蛋白的质粒，它是pBR322来源。结构图见图1，重组质粒的构建图见图2，酶切鉴定图见图3。

　　图1－图3  （略）
3  成功获得融合蛋白的表达

        融合蛋白预期分子量为38kD（Megalin 3189-4169约35kD，加上N末端的6xHis有3kD）。带重组质粒的TOP 10 经IPTG诱导后，再用Western-Blot检测得到蛋白条带位于47kD与33kD之间，与预期大小相符。不带质粒的TOP 10经诱导无蛋白条带；阳性对照TOP 10/CAT在IPTG诱导前没有条带出现，而在IPTG诱导后4h出现大小为33kD的蛋白条带。证明本实验成功获得了Megalin基因片段3189-4169融合蛋白。见图4。
　　图4－图5（略）
　　4  结果
　　RT-PCR获得大鼠肾Megalin基因片段3189-4169（共1000bp），并测序。Megalin基因片段3189-4169是Megalin基因第2簇配体结合区，共981个碱基（bp）；加上2个引物前的酶切位点和保护碱基（19个bp），故整个目的片段的分子大小应为1000bp。本实验利用两种不同PCR体系均获得1000bp的目的片段。为了保证PCR的忠实性，后期克隆所选择的是用Roche公司的Expand Long Template PCR System获得的目的片段。图6显示目的片段与DNA标准1000bp位置平行，大小一致（Marker是DNA100bp梯度，其中较亮的条带分子大小为500bp）。
　　图6  融合蛋白表达图　（略）
　　5  讨论
　　大鼠Heymann肾炎因其临床过程和病理类型与人类膜性肾病非常相似，已作为人类膜性肾病的动物模型使用40余年。其发病机制尚未完全清楚，对它的研究主要集中在探讨其免疫复合物形成的机制和免疫复合物形成后对肾小球的损伤上。对前一个问题的研究由于很早人们就发现HN是原位免疫复合物沉积，因此人们研究的方向转入寻找原位抗原及其抗原决定簇的定位，包括T细胞决定簇和B细胞决定簇。对后一个问题则事实上要探讨蛋白尿形成的原因，人们发现多种因素均可造成肾小球滤过膜的损伤，其中最重要的是补体机制的参与、攻膜复合物（C5b-9）对肾小球足细胞的损害，由此可以产生后续损伤机制的激活［13］。
　　HN抗原研究确定抗原位于肾近端小管［14］,致病的是一部分特异抗原，命名为RTEα5，是一个脂蛋白分子，存在于大鼠肾近端小管刷状缘上皮细胞胞膜中。起初人们认为用RTEα5注射大鼠可诱导出HN，尽管它不是肾小球的成分，但它也可随免疫复合物和补体一起呈颗粒状沉积在肾小球毛细血管网，因此人们认为HN的发病是由循环免疫复合物沉积在肾小球所导致的［15，16］。后来的研究很快推翻了这个观点,因为用抗体灌注孤立的肾脏，也有免疫复合物的沉积，这清楚地提示循环抗体是与肾小球固有抗原结合才形成免疫复合物的沉积［17］。但是这个固有抗原的定位研究开始并不统一，1982年Kerjaschki D和 Farquhar MG用肾洗脱IgG沉淀出HN特异抗原，显示为刷状缘胞膜上一种单一的糖蛋白，SDS-PAGE表明该分子的分子量为330kD，并以此命名为gp 330；用纯化的gp 330可以诱导aHN，其产生的抗体也可诱导pHN，而去除gp 330则不能诱导产生HN；这些充分证明gp 330是HN的致病抗原［1］。1983年他们又用免疫组化方法证实gp 330除肾小管刷状缘外，的确还定位在大鼠肾上皮细胞的胞被小凹处，从而又为HN的发病是原位免疫复合物学说提供了有力的证据［2］。同时期的Marker SP等人通过对Fx1A的生化分析、亲合层析等方法鉴定致病抗原是一分子量为600kD的糖蛋白，命名为gp 600；它也充分显示出致病的特性,直接注射大鼠可以诱导产生aHN，其抗体可以诱导产生pHN，另外Fx1A中仅gp 600可以与肾病自身抗体反应。SDS-PAGE电泳显示为5条带，分别从70~330kD，考虑是由于gp 600分子量太大，电泳时分解所致；综合Kerjaschki D的研究，Marker SP还认为gp 330是gp 600的一部分或者说gp 600是gp 330的前体［18］。1989年Raychowdhury R等人发现gp 330与人低密度脂蛋白受体具有同源性，提示gp 330属于低密度脂蛋白受体家族成员［19］。此后人们又鉴定出HN另一抗原成分，分子量为39kD，即受体相关蛋白（RAP）；因其与gp 330具有一定的同源性，故起初认为它是gp 330的一部分，后来发现它是一种独立的蛋白［20，5］。研究显示RAP是gp 330的分子伴娘，它与gp 330紧密结合在一起，形成HN抗原复合物，而导致HN的发作。对RAP抗原位点的研究现已精确定位到N末端的15个氨基酸（39-44氨基酸）。Megalin的研究显示并不是整个gp 330分子都具有致病性，因此人们致力于寻找gp 330上的致病抗原决定簇。1994年gp 330基因全长被克隆出来,确定它有4660个氨基酸，成熟分子的分子量为516kD，包括N末端信号肽、细胞外区域（4400个氨基酸）、一个穿膜区域（22个氨基酸）和C末端的胞浆尾（213个氨基酸）。细胞外区域包含三种类型富含半胱氨酸的重复序列，它们也是低密度脂蛋白受体（LDLR）基因家族的特征；即36个LDLR配体结合重复序列形成了4个潜在的受体配体结合簇，16个生长因子重复序列被8个YWTD空间区域所分隔开，还有一个C末端的上皮生长因子重复序列。胞浆尾包括2份重复的（FX）NPXY基序，它代表了胞被小凹内化的信号，另外还有一个和NPXY类似基序。gp 330整个的结构证实是低密度脂蛋白受体家族成员，且因其分子量巨大，被命名为Megalin。当然gp 330与这些低密度脂蛋白受体家族成员也存在一些不同之处，表现在：（1）半胱氨酸富集的重复序列被排列在细胞外区域N末端和C末端的顶头；（2）在YWTD空间区域半胱氨酸残基的分布方式；（3）与furin识别序列一致的RX（K/R）R的定位，而furin是处理内源性蛋白酶的前体；（4）胞浆尾的长度和结构。这些差异可能提示其独特的生理和病理作用。
　　考虑到Megalin基因胞外区的4簇胱氨酸富集区（分别含有7、8、10、11个低密度脂蛋白受体配体结合重复序列），最有可能存在潜在致病抗原决定簇。因此1996年Akihiko Saito等分别截取这4簇cDNA片段，用轮状病毒体系表达融合蛋白，再用pHN血清进行免疫沉淀，发现仅有第2簇的表达产物可以被检测到。此后，进一步截短第2簇蛋白，发现第5个配体结合重复序列（氨基酸1160-1205）包含有主要的抗原决定簇［11］。同时Robert A.Orlando等［6］人通过RAP具有阻止一些配体与Megalin结合的特性，发现乳铁蛋白、抑肽酶、脂蛋白脂肪酶、RAP等与Megalin结合均分别存在于第2簇配体结合区内的同一位点，大致位置在氨基酸1111-1210附近。这些现象引起大家对Megalin第2簇配体结合区的注意，Megalin的第2簇配体结合区域类似LDL受体的配体结合区域，含有8个胱氨酸富集重复序列（A类基序），每一个序列又包含一个高度保守的丝氨酸-天门冬氨酸-谷氨酸序列和一个保守的6个半胱氨酸残基间隔序列，其中丝氨酸-天门冬氨酸-谷氨酸序列出现在Megalin每一A类基序的第5和第6个半胱氨酸之间，它有助于Megalin与其配体之间的相互作用（电荷依赖）。故人们认为Megalin的第2簇配体结合区域在HN发病和配体结合方面均发挥重要作用。但后来的一些研究却提出不同看法，1998年H Yamazaki等［21］人用抗Megalin 4簇基因融合蛋白分别诱导pHN，间接免疫荧光显示抗其他3簇配体结合区域的抗体与第2簇一样可出现免疫复合物的沉积；因此他们认为Megalin 4簇配体结合区均可能包含抗原决定簇。2000年Andrew V.Oleinikov等［12］又发现gp 600 N末端的一小部分约60kD的蛋白，定位在Megalin的第1簇配体结合区和第1个YWTD分隔区（Western Blot结果显示位于gp 600氨基酸180-453），可以诱导完整的aHN；故他们认为这一段蛋白才包含Megalin的T和B抗原决定簇。
　　由上可知，Megalin抗原决定簇位点的研究并不统一，本实验以Megalin基因第2簇配体结合区域为起点，运用分子克隆技术将其第二段基因3189-4169（氨基酸序列998-1324）与原核表达载体pTrcHis A重组，并成功获得其融合蛋白。为下一步截短融合蛋白，确定抗原决定簇的定位以及研究其相应功能打下一定的基础。对Heymann肾炎分子免疫机制的研究，尤其是Megalin基因抗原决定簇的定位，将可根据该病理性抗原决定簇的碱基序列，人工合成较短的多肽疫苗，诱导免疫耐受或者导入体内特异性地封闭病理性抗原决定簇与循环抗体的接触，阻止免疫复合物的形成，从而为人类膜性肾病和一些自身免疫性疾病的治疗开辟一条新的途径。
　　【参考文献】
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