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灵芝孢子能够调节妊高征大鼠所生幼鼠 海马线粒体相关分子物质的水平           ★★★ 【字体：小 大】
灵芝孢子能够调节妊高征大鼠所生幼鼠 海马线粒体相关分子物质的水平
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-1    
作者：程进军， 曾园山， 熊轶， 张伟， 陈穗君， 钟志强
【摘要】  探讨灵芝孢子对妊高征大鼠所生幼鼠海马线粒体相关分子物质的影响。方法:用一氧化氮合酶（nitric oxide synthase， NOS）抑制剂N硝基左旋精氨酸甲酯（Nw-nitro- L- arginine methylester， L- NAME）给予大鼠腹腔注射制备妊高征模型， 在此基础上胃饲灵芝孢子。应用cAMP放免法、RT-PCR、酶活力检测等技术评价灵芝孢子对妊高征大鼠所生幼鼠海马线粒体相关分子物质水平的影响。结果:妊高征孕鼠的刚分娩幼鼠海马cAMP水平、线粒体DNA（mtDNA）水平及ATP合酶活力都降低。pgc1α表达水平与正常对照大鼠比较没有变化。 生后30 d的幼鼠海马cAMP水平、mtDNA水平、ATP合酶活力和pgc1α表达水平低于正常对照大鼠。胃饲灵芝孢子后，妊高征大鼠的刚分娩幼鼠和生后30 d的幼鼠海马cAMP水平和mtDNA含量恢复到正常对照大鼠水平，ATP合酶活力和pgc1α表达水平也有恢复性增高。结论:灵芝孢子具有调节妊高征大鼠所生幼鼠海马线粒体相关分子物质水平的作用。
【关键词】  大鼠
　　灵芝孢子（ Ganoderma spore， GS）是经过现代技术加工处理的灵芝生殖细胞，具有一定的防治疾病的功效。本研究组以往研究发现，灵芝孢子可以促进受损伤的神经元存活及其轴突再生［1， 2］，这提示灵芝孢子具有神经生物活性。一氧化氮（nitro-gen monoxide， NO）是调控神经系统和心血管系统功能的重要信使分子。在妊娠高血压征（妊高征）孕妇的血液中发现，NO和精氨酸的含量降低［3］。我们也发现，应用一氧化氮合酶（nitric oxide syn-thase， NOS）抑制剂N硝基左旋精氨酸甲酯（Nw-nitro- L- arginine methylester， L- NAME）抑制NO生成，可以造成孕鼠的血压升高及其胎鼠和所生幼鼠海马的损伤，喂服灵芝孢子后可以部分缓解NO水平降低引起的损害［4， 5］。最新研究提示，NO可以促进线粒体生物发生（mitochondrial biogenesis）［6］。然而，妊高征孕鼠的NO水平降低是否引起其所生幼鼠海马线粒体生物发生障碍，目前尚未见报道。本研究试图探讨灵芝孢子对妊高征大鼠所生幼鼠海马线粒体相关分子物质水平的影响，为临床服用灵芝孢子干预妊高征提供实验资料。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验动物 SD成年雌性大鼠40只，体质量200～230 g，11～12周龄;SD成年雄性大鼠10只，体质量250～300 g，13～15周龄。由中山大学实验动物中心提供，合格证号为（医动字）第26-99C016号。按雌雄比例为2∶1合笼后的第2天观察雌鼠阴道黏液（涂片法），有精子者被认为是妊娠0天（E0）。将这些妊娠鼠随机分为:（1）正常对照组，于妊娠14～20 d（E14～E20）腹腔注射生理盐水+胃饲蒸馏水;（2） L -NAME+蒸馏水组，注射 L -NAME+胃饲蒸馏水;（3） L -NAME+精氨酸组，注射 L -NAME+胃饲 L -精氨酸100 mg/（kg·d），分2次胃饲;（4） L -NAME+灵芝孢子组，注射 L -NAME+胃饲灵芝孢子8 g/（kg·d），分2次胃饲;（5）灵芝孢子+ L -NAME+灵芝孢子组，注射 L -NAME前 1周 胃饲灵芝孢子8 g/（kg·d），注射 L -NAME后胃饲灵芝孢子8 g/（kg·d），均分2次胃饲。每组 5只。 除正常对照组每天分两次注射生理盐水和胃饲蒸馏水外，各组妊娠鼠于E14～E20腹腔注射 L -NAME 60 mg/（kg·d），分2次注射，2次之间相隔10 h。每次注射后2 h，再接着胃饲相应的蒸馏水、 L -精氨酸或灵芝孢子。
　　1.2 药物 L -精氨酸购自美国Amresco公司， L -NAME 购自美国Sigma公司。灵芝孢子（2036）购自Holistal International Ltd，批号GANSP- SP04040104。 L -NAME用生理盐水配制成溶液， L -精氨酸用蒸馏水配制成溶液，灵芝孢子用羧甲基纤维素钠配制成溶液。
　　
　　1.3 取材 从上述处理的每只孕鼠刚分娩的0 d（P0）幼鼠中随机选择3只，取其海马组织，分别用放射免疫、RT-PCR以及酶活力测定等方法进行相关检测。剩余幼鼠饲养至生后30 d（P30）后用戊巴比妥钠麻醉后放在冰盘上分离海马组织，同样用上述方法作各项相关检测。
　　1.4 放射免疫法检测cAMP水平 每只幼鼠海马组织称质量后，放入盛有2 ml冷冻醋酸缓冲液 （50 mmol/L， pH 4.75）的试管内，在冰上匀浆后加入 2 ml 无水乙醇，混匀，静置5 min，3 500 r/min离心 15 min， 离心半径为16.3 cm。60 ℃烘箱中烘干，4 ℃保存。测量时用1 ml醋酸缓冲液溶解后取 0.1 ml 检测。检测步骤及结果计算按照试剂盒要求操作。cAMP放免试剂盒购自上海中医药大学核医学实验室。
　　1.5 RT-PCR检测相关基因转录 P0和P30幼鼠中各收集3例分离海马组织。将获取的每只幼鼠海马组织，按照Trizol试剂（北京赛百胜公司）说明一步法提取组织总RNA。取2 μl RNA经RT反应体系作用，在下列条件下合成cDNA:70 ℃ 5 min， 42 ℃ 60 min，94 ℃ 5 min。取RT产物1 μl对如下引物进行PCR。Peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 alpha （pgc1α）引物序列为:上游引物，5'cacagattcaagccagtgctac3';下游引物，5'cggagagttaaaggaagagcaa3'。tfam引物序列为:上游引物，5'gaaacgcctaaagaagaaagca3';下游引物， 5'aagtccatgggctacagaaaaa3'。 GAPDH引物序列为:上游引物，5'aacaagtaaccctcaaccctg3';下游引物，5'acac-cctctgatacccacatt3'。PCR反应程序:94 ℃预变性2.5 min。然后进入以下29个循环:94 ℃变性45 s，54 ℃退火1 min;72 ℃延伸1.5 min。循环完毕，72 ℃延伸5 min中止反应。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，ImageTool软件进行目的条带光密度分析。
　　1.6 mtDNA水平测定 将获取的每只幼鼠海马组织，按照试剂盒（上海杰美基因公司）说明提取DNA，并按照如下引物应用PCR分别扩增COX3、COX4和GAPDH。COX3引物序列为:上游引物， 5'atgaccactaacaggagcccta3' ;下游引物，5'taggggattta-aaggggtgatt3'。COX4引物序列为:上游引物， 5'ggactcagaactcaagggacac3'; 下游引物，5'tgatgttggt-cactttttccac3'。扩增产物应用1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照，ImageTool图像分析软件分析目的条带光密度，进行统计学分析。
　　1.7 酶活力测定 乳酸脱氢酶（lactate dehydro-genase， LDH）、乳酸、丙酮酸激酶（pyruvate kinase， PK）、ATP合酶（ATPase）和谷氨酰胺合成酶（glu-tathione synthetase， GS）测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。各酶活力和组织乳酸含量测定按照试剂盒说明书步骤进行。
　　1.8 统计学方法 上述所得各组实验数据做单因素方差分析，数据处理均采用SPSS 10.0统计分析软件。
　　2 结果
　　2.1 海马cAMP水平 L- NAME+蒸馏水组P0海马cAMP水平相比于正常对照组有所下降。 L- NAME+蒸馏水组P30海马cAMP水平低于其他4组，且差异有统计学意义。 L- NAME+灵芝孢子组和灵芝孢子+ L- NAME+灵芝孢子组的P0和P30海马cAMP水平均恢复到正常对照组水平，而且明显高于 L- NAME+蒸馏水组水平。见表1。
　　表1 各组P0和P30幼鼠海马cAMP水平（略）
　　Table 1 cAMP level in hippocampus of P0 and P30 young rats
　　*P <0.05，**P <0.01， vs L -NAME+distilled water group. P0: new-natal rats; P30: 30-day post-natal rats.
　　2.2 pgc1α与tfam基因表达 与正常对照组比较， L- NAME+蒸馏水组的P0海马线粒体pgc1α表达差异无统计学意义，但是P30海马线粒体pgclα表达明显下降。P0和P30海马线粒体tfam表达均降低。 L- NAME+灵芝孢子组P0和P30海马线粒体pgc1α及tfam表达比 L- NAME+蒸馏水组的均有增高。灵芝孢子+ L- NAME+灵芝孢子组P0海马线粒体pgclα和tfam表达与 L- NAME+蒸馏水组比较，差异无统计学意义，但是P30海马线粒体pgclα和tfam表达则明显增高。 L -NAME+精氨酸组P0海马线粒体tfam表达比 L -NAME +蒸馏水组的有所增高，其他则未见有明显差异。应用RT-PCR结合图像分析技术检测线粒体生物发生相关基因表达的结果见图1，表2。
　　2.3 mtDNA水平 COX3是线粒体基因组编码的一种基因。应用文献推荐的方法［7］比较各组海马mtDNA水平，P0海马mtDNA水平在正常对照组与 L- NAME+蒸馏水组之间差异无统计学意义，但是P30海马mtDNA水平在 L- NAME+蒸馏水组明显低于正常对照组。 L- NAME+灵芝孢子组P0海马mtDNA水平比 L- NAME+蒸馏水组明显增高。各组P30海马mtDNA水平与 L- NAME+蒸馏水组相比，差异有统计学意义，其中应用灵芝孢子的2个组mtDNA水平基本恢复到正常对照组水平。而P0和P30海马细胞核基因组编码的COX4表达水平各组间未见明显差异。见图2、表3。
　　2.4 酶活力检测 在P0海马中，LDH活力在 L -NAME+蒸馏水组有所升高，与正常对照组相比，差异有统计学意义。 L -NAME+灵芝孢子组、灵芝孢子+ L -NAME+灵芝孢子组和 L -NAME+精氨酸组P0海马LDH活力基本恢复到正常对照组水平。然而，各组P30海马LDH活力之间均无差异。与正常对照组比较，P0和P30海马乳酸水平在 L -NAME+蒸馏水组没有明显变化，但 L -NAME+精氨酸组P30海马乳酸水平明显升高。与 L -NAME+蒸馏水组比较，应用灵芝孢子的2个组P0和P30海马乳酸水平均有所下降。与正常对照组相比，P0海马PK活力在 L -NAME+蒸馏水组和 L -NAME +精氨酸组明显升高，应用灵芝孢子的2个组均有下降，基本与正常对照组无差异。各组P30海马PK活力基本无差异。与正常对照组比较，P0和P30海马ATP合酶在 L -NAME+蒸馏水组和 L -NAME+精氨酸组明显下降，应用灵芝孢子的2个组则ATP合酶活力部分恢复。与正常对照组比较，P0和P30海马GS酶活力在 L -NAME+蒸馏水组均有不同程度的降低。 L -NAME+精氨酸组P0海马GS酶活力与 L -NAME +蒸馏水组没有差异。应用灵芝孢子的两个组P0海马GS酶活力比 L -NAME +蒸馏水组有所升高，其中灵芝孢子+ L -NAME +灵芝孢子组基本恢复到正常对照组水平。应用灵芝孢子的2个组P30海马GS酶活力比 L -NAME+蒸馏水组的明显增高。见表4和表5。
　　图1 RT-PCR检测pgclα和tfam表达水平（略）
　　Figure 1 Expression levels of pgclα and tfam determined by RT-PCR
　　n: Normal control group， P0; m: L- NAME+distilled water group， P0; a: L- NAME+arginine group， P0; g: L- NAME+GS group， P0; p: GS + L- NAME+GS group， P0; N: Normal control group， P30; M: L- NAME+distilled water group， P30; A: L- NAME+arginine group， P30; G: L- NAME+GS group， P30; P: GS+ L- NAME+GS group， P30; L: 100 bp DNA marker. n =3. P0: new-born rats; P30: 30-day post-natal rats.
　　表2 各组P0和P30幼鼠海马线粒体生物发生相关基因表达水平（略）
　　Table 2 Expression levels of mitochondrial biogenesis related genes in hippocampus of P0 and P30 young rats
　　*P <0.05，**P <0.01， vs normal control group;△P <0.05，△△P <0.01， vs L -NAME+distilled water group. P0: new-natal rats; P30: 30-day post-natal rats.
　　图2 PCR扩增COX3和COX4基因（略）
　　Figure 2 COX3 and COX4 gene amplification through PCR
L: 100 bp DNA marker; n: Normal control group，P0; m: L -NAME+distilled water group， P0; a: L -NAME+arginine group， P0; g: L -NAME+GS group， P0; p: GS+ L -NAME+GS group， P0; N: Normal control group， P30; M: L -NAME+distilled water group， P30; A: L -NAME+arginine group， P30; G: L -NAME+GS group， P30; P: GS+ L -NAME+GS group， P30. n =3. P0: new-born rats; P30: 30-day post-natal rats.
　　表3 各组P0和P30幼鼠海马mtDNA水平（略）
　　Table 3 mtDNA levels in hippocampus of P0 and P30 young rats
　　*P <0.05，**P <0.01， vs normal control group;△P <0.05，△△P <0.01， vs L- NAME+distilled water group. P0: new-born rats; P30: 30-day post-natal rats.
　　表4 各组P0幼鼠海马代谢相关酶活力（略）
 
　　Table 4 Activities of metabolism related enzymes in hippocampus of P0 young rats
　　*P <0.05，**P <0.01， vs normal control group;△P <0.05，△△P <0.01， vs L- NAME+distilled water group. P0: new-born rats.
　　表5 各组P30幼鼠海马代谢相关酶活力（略）
　　Table 5 Activities of metabolism related enzymes in hippocampus of P30 young rats
　　*P <0.05，**P <0.01， vs normal control group;△P <0.05，△△P <0.01， vs L- NAME+distilled water group. P30: 30-day post-natal rats.
　　3 讨论
　　在前期研究中，我们已经观察到NOS抑制剂 L -NAME可以降低妊娠小鼠血清NO水平，同时其E21胎鼠海马的NOS表达受到抑制，但是其所生（P30）幼鼠海马的NOS表达却比同龄幼鼠有所增加，结果E21和P30海马神经元死亡增多［4］。关于NOS表达降低或增强是如何引起细胞死亡的机制，目前还不清楚。最近有研究报道［7］，抑制未成熟的海马神经元NOS表达会引起线粒体依赖的细胞凋亡。然而，在成熟的海马神经元中，促进其NOS表达则可以使细胞死亡。这提示在海马神经元的不同发育时期，NO的作用效果是不一样的。那么，NO是否通过调节细胞线粒体相关分子物质水平的变化来影响细胞的死亡，这就是本研究在先前研究结果［4， 5］的基础上感兴趣探讨的问题之一。COX3是线粒体基因组（mtDNA）的一个编码基因，该基因的表达产物是作为线粒体呼吸链上的细胞色素C氧化酶复合体的一个成员。通过分析COX3基因的拷贝数与细胞核基因组编码的 GAPDH 基因拷贝数的比值，在一定程度上可以反映mtDNA的水平［8］。COX4基因的表达产物是作为线粒体呼吸链上的细胞色素C氧化酶复合体的另一个成员。在本研究中发现，NOS抑制剂可以降低妊娠大鼠所生P30幼鼠海马mtDNA水平。但 是，在P0幼鼠海马则没有观察到mtDNA水平下降的现象，其原因可能是多方面的。其中可能与本研究检测的样本量较少有关，也可能与未使用定量PCR检测方法有关。pgclα是与mtDNA转录水平有密切关系的一种转录因子。本研究应用NOS抑制剂后，在P30海马中pgclα表达明显降低。pgclα作为一种转录因子可以促进细胞核来源的呼吸因子NRF表达，进而促进mtDNA转录和复制。pgclα也有可能调节cAMP的水平［9］。本研究发现，应用NOS抑制剂后P30幼鼠海马的cAMP水平也明显下降，提示pgclα的表达与cAMP的水平之间可能存在一定关系。另外，pgclα通过调节NRF家族系列因子，可能促使tfam的转录。tfam是细胞核基因组编码的另一种转录因子，该因子调控mtDNA转录过程［10］。当pgclα表达降低时也可能会影响tfam的表达，因为本研究观察到，应用NOS抑制剂后，P0和P30海马的tfam表达水平也是明显降低的。线粒体是细胞能量的源泉。正常情况下，其主要能量代谢方式是以有氧代谢—— —三羧酸循环为主。当局部组织微环境改变时，细胞能量代谢方式也可能随之发生变化。此外，有研究证实，pgclα也具有调节线粒体能量代谢的作用。本研究应用NOS抑制剂后，P0海马无氧糖酵解相关的酶如PK、LDH等活力升高。 然而，P0和P30海马有氧三羧酸循环相关的酶如ATP合酶活力明显降低。这提示NOS抑制剂可以干扰出生后幼鼠海马的能量代谢过程。这一现象产生的原因可能是由于海马细胞线粒体相关分子物质水平的变化造成的，也可能是海马组织缺氧状态及其兴奋性氨基酸代谢失常而引发线粒体的功能障碍等因素参与。因为在本研究中P0和P30海马GS酶活力明显下降，这表明海马细胞的谷氨酸代谢可能出现障碍。我们先前的研究也表明［4］，应用NOS抑制剂后海马的低氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α）表达是增加的，提示海马组织有缺氧状态。这些研究结果都支持上述有关线粒体功能障碍原因的推测。服用灵芝孢子后，妊高征孕鼠血清NO恢复到正常水平，从而改变其胎鼠和所生幼鼠海马神经元的NOS表达水平，缓解海马组织缺氧状态，结果恢复其所生幼鼠的空间学习记忆和运动能力，可能起到保护胎鼠及其所生幼鼠海马结构的正常发育以及健全海马正常功能的效果［4， 5］。在本研究中发现，应用灵芝孢子后海马细胞的cAMP水平升高， mtDNA 含量增加，相关代谢酶的活力基本恢复到正常水平。这些效应可能参与了上述海马结构与功能的修复过程［4， 5］。这些效应有可能与灵芝孢子提高海马细胞的pgclα表达水平有关。我们推测，灵芝孢子来源的一些生物活性分子直接或间接诱导pgclα的表达增加，进而调节线粒体相关分子物质水平。另外，海马组织缺氧状态可以降低mtDNA转录和复制，降低线粒体电子呼吸链中酶的活力，缓解缺氧以后可以逆转海马线粒体这些损伤性变化［11］。我们前期研究发现，灵芝孢子能够缓解海马组织缺氧状态［4］。这可以部分解释灵芝孢子具有调节妊高征大鼠所生幼鼠海马线粒体相关分子物质水平的作用，从而达到维护线粒体正常能量代谢的目的。 在本研究中，我们设置了两种服用灵芝孢子的方案。综合而言，两组之间的药效差异并不明显，提示预服用灵芝孢子组可能因预先服用的时间较短，所以与后服用灵芝孢子组的药效之间无明显差别。
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