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猪冠状动脉再狭窄模型的建立和血管内超声评价           ★★★ 【字体：小 大】
猪冠状动脉再狭窄模型的建立和血管内超声评价
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-1    
作者：丁澍，马根山，陈立娟，冯毅，沈成兴，刘孝军，王积慧
【摘要】  目的 建立猪冠状动脉再狭窄模型，并用血管内超声（IVUS）进行评价。方法 选择健康小型猪9头，在左前降支中段植入金属裸支架［支架/血管直径=（1.1～1.2）/1.0］，术后第28天复查造影、IVUS，并行组织形态学检查观察再狭窄情况。 结果 4头猪在支架植入2 h内死亡，5头猪完成28 d复查，定量冠脉造影（QCA）示支架植入后血管直径为 （2.90±0.26） mm，比植入前基础血管直径［（2.52±0.31）mm］明显增大（ P =0.001）;随访期血管直径［（1.20±0.77）mm］较植入后血管直径明显减小（ P =0.002），直径狭窄百分比为（60.2±23.5）%，支架内再狭窄率为60%。组织形态学检查 示管腔面积与支架内面积相比明显减小［（1.29±1.02）mm 2vs（6.04±1.21）mm2，P <0.01］，平均面积狭窄百分比为（77.9±19.7）%。IVUS检查结果类似［管腔面积（1.67±1.17）mm2vs（5.85± 0.94）mm
2 ，P <0.01］;平均面积狭窄百分比为 （71.0±23.3）%。两种检查手段测得的支架内面积、管腔面积、新生内膜面积和平均面积狭窄百分比相比差异无统计学意义 （ P >0.05） 。结论 成功建立猪冠状动脉再狭窄模型，IVUS检查可作为猪冠脉再狭窄模型支架内再狭窄的评价手段。
【关键词】  冠状动脉模型;血管再狭窄;血管内超声;新生内膜;猪
　　经皮腔内冠状动脉成形术（PTCA）和支架植入术的临床应用极大地改善了冠心病患者的预后，但10%～ 50%的再狭窄率限制了PTCA和支架植入术的发展。本研究以小型猪冠状动脉植入较大直径支架建立再狭窄模型，并通过血管内超声（IVUS）进行评价。  
　　1 材料和方法   
　　1.1 动物选择和材料准备 
　　健康小型猪9头，体重30～40 kg，月龄6～9个月，雌雄不限，整个实验期间予普通谷物饲养。维科医疗器械有限公司提供的金属裸支架9枚，均为管状，直径2.5～3.0 mm，长15～20 mm。小鼠抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体（clone PC10，DAKO）浓缩液和抗体稀释液由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。 
　　1.2 支架植入方法 
　　术前日喂饲拜阿司匹林300 mg、波立维225 mg。禁食禁水12 h，予氯胺酮（12mg·kg-1）肌注基础麻醉，3%戊巴比妥钠20 mg · kg-1术前和术中间断静注强化麻醉。用外科手术方法暴露颈动脉或股动脉，置6F鞘管，注入肝素150～200 U · kg-1，行定量冠状动脉造影 （QCA）并在左前降支中段植入金属裸支架1枚［支架/  血管=（1.1～ 1.2）/1.0］，扩张压为10～15 atm （1 atm= 101.325 kPa），每次30 s，两次扩张间隔1 min。15 min 后复查QCA证实管腔通畅，无充盈缺  损、管壁夹层和支架移位。行IVUS检查（JOMED   Viewsonic PF 775）证实支架贴壁良好。术毕结扎动脉，青霉素480万U · d-1肌注3 d预防感染;波立维75mg·d-1喂饲28 d;拜阿司匹林300 mg·d-1 喂饲7 d后改为100 mg·d-1喂饲21d，共28 d。 
　　1.3 QCA和IVUS复查 
　　术后28 d行QCA和IVUS检查观察再狭窄情况。随访期QCA测定血管参考直径，在支架段血管近  端、中间、远端测定后取平均值。 平均直径狭窄百分比（%）=（1-随访期血管参考直径/植入后直径）×100。IVUS检查测定支架内面积、管腔面积;新生内膜面积=  支架内面积-管腔面积;面积狭窄百分比（%）=（1-管  腔面积/支架内面积）×100。  
　　1.4 组织形态学检查和免疫组化 
　　QCA和IVUS复查后予10%氯化钾静注处死动物，分离心脏，10%中性缓冲福尔马林液从主动脉残端以100 mmHg（1 mmHg = 0.133 kPa ）压力灌注固定30 min。分离含支架血管段，从支架正中横切，近段标本以10%中性福尔马林固定24 h，送至上海中山医院  心脏病研究所制成100 μm厚切片并行HE染色。计算支架内面积、管腔面积、新生内膜面积和狭窄面积百分比。冠脉损伤程度根据Schwartz等的方法计算损伤评分。远段标本移去支架丝，切片行PCNA染色，通过计算机辅助系统放大400倍在新生内膜中随机取  5块0.1 mm2大小区域计算平滑肌细胞密度（SMCs），通过计算PCNA阳性SMCs占总SMCs的比例得出  增殖SMCs比值。
　　2 统计学分析  
　　计量资料以 x-±s 表示，用SPSS 11.5统计软件行t 检验， P <0.05差异有统计学意义，P <0.01差异有  非常显著性意义。  

　　3 结 果   
　　9头小型猪均成功在前降支中段植入金属裸支架，其中4头在支架植入后2 h内死亡，死因分别为急性心包压塞、大出血和麻醉意外。死亡后即刻分离支架血管段，小心抽去支架丝，HE染色光镜下见支架段  血管内弹力膜剥脱，中膜压缩，局部较多炎症细胞聚集（图1）。支架近端血管和远端血管管壁正常，偶见少数  炎症细胞局部聚集。其余5头猪安全存活至试验期结束，复查QCA示支架植入后血管直径为（2.90±0.26）mm，比植入前基础血管直径［（2.52±0.31）mm］明显  增大（P =0.001），支架/血管比为1.13±0.02;随访期血管直径（1.20±0.77）mm，较植入后血管直径明显减小（ P =0.002），直径狭窄百分比为（60.2±   23.5）%，支架内再狭窄率为60%，成功建立猪冠状动脉再狭窄  模型。IVUS和组织形态学检查结果见表1和图2，两种检查手段测得的支架内面积、管腔面积、新生内膜面积、平均面积狭窄百分比比较差异无统计学意义，提示IVUS可替代组织形态学检查来定量评价支架内再狭窄情况;管腔面积与支架内面积相比均明显减小，提示新生内膜增生明显。 表1 术后28 d IVUS和组织形态学检查结果比较（略）
　　4 讨  论   
　　近年来的研究表明，PTCA术后再狭窄的机制主要是新生内膜增生、血栓形成、血管重构和血管的弹性回缩［1-2］。支架的应用消除了血管重构和血管弹性回缩，但并未阻止甚至促进了以平滑肌增殖和迁移为特征的新生内膜增生。以往曾经选用犬、家兔、大鼠等多种动物作为再狭窄模型，但均不合适［3-5］。犬有双重冠脉系统，新生内膜不易诱导成功。兔髂动脉和颈总动脉球囊扩张后狭窄系非平滑肌细胞增殖迁移所致。大鼠对动脉粥样硬化具有抗性，诱导的再狭窄病变与人类相比在形态学和病理生理学上都有很大差异。非人灵长类种间差异复杂、获取困难、饲养费用高等限制了其应用［6］。成年猪的冠状动脉分布、口径、结构与人相似，冠脉血流动力学特征和血小板特点也与人类似，从脂质沉淀、泡沫细胞形成到纤维细胞增生钙化的时序也与人相同。对猪冠状动脉采用大球囊扩张术后易形成损伤性狭窄，病理过程与人PTCA术后再狭窄相仿［7］。本研究采用小型猪冠脉内植入较大支架［支架/ 血管=（1.1～1.2）/1.0］成功诱发了支架内新生内膜增生，病理和免疫组化结果提示支架内狭窄明显，新生内膜平滑肌细胞增殖和细胞外基质增生，与人支架植入术后再狭窄病理过程相似，与国内外文献［8-9］报道一致。国外相关研究表明，猪冠脉内弹力膜断裂和中膜压缩撕裂可诱导明显的平滑肌细胞迁移和增殖，导致新生内膜增生和再狭窄，并且不依赖于高胆固醇饮食［7］。与血管直径相仿的球囊或支架仅诱导轻微的内膜增生［10］，过大球囊扩张或过大直径支架植入使内膜增生明显。本实验血管损伤评分均在1分以上，均在支架植入部位诱导了明显的内膜增生。本实验观察到内膜和中膜损伤后2 h即出现炎性细胞局部浸润，炎性细胞的浸润和炎症介质的释放可激活血小板和凝血系统，在支架撑竿处及内弹力膜断裂处形成微小血栓。局部炎症在术后第7天达到顶峰，此后处于平台期，28 d时仍然明显［11］。炎症反应和血栓的形成在再狭窄早期占有重要地位，而伴随着炎性细胞浸润的平滑肌细胞迁移增殖则逐渐成为再狭窄形成的主要动力。初期少量的增殖平滑肌细胞与机化的纤维蛋白血栓、中性粒细胞、巨噬细胞形成混合体，之后增殖加速，在术后第7天时达最快速度，28 d时内膜增生达到顶峰，并一直持续至术后3～6个月［3］。
本研究的一个特点是通过IVUS评价猪冠脉再狭  窄模型。IVUS不仅可以观察血管腔大小、管壁的组成和病变等形态结构，而且可以观察其收缩和舒张等功能变化;不仅可以对病变进行定性分析，而且还可以进行精确的定量分析，这是离体的组织学检查等其他  检查手段［12-13］所不能相比的。本研究支架植入后经  IVUS检查证实支架贴壁良好，无局部血管夹层、动脉瘤、血管壁内血肿或血管破裂及较大的新鲜血栓形成，消除了影响术后支架内再狭窄率的因素，控制了操作过程中引起的偏倚。术后28 d IVUS和组织形态学检查对支架段血管结构、支架内斑块负荷、支架内再狭窄率等所得结果相似，也证实了IVUS可作为支架内再  狭窄研究的很好手段。近年来Kursaklioglu等［14］报道了在猪冠脉再狭窄模型中采用QCA和IVUS相结合的方法观察紫杉醇洗脱支架预防再狭窄的作用，Yokoyama等［15］也报道了采用定量IVUS观察猪模型  中抗氧化剂普罗布考抑制新生内膜增生的实验，国外还有其他类似报道［16-17］，国内尚未有报道。  
【参考文献】
  　　［1］ Hoffmann R，Mintz G S，Dussaillant G R，et al.Partterns and mechanisms of in-stent restenosis.A serial intravascular ultra-sound study ［J］.Circulation，1996，94（6）:1247-1254.

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