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| PTTG、VEGFC 的表达及微淋巴管密度与非小细胞肺癌临床病理特征的关系 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-1  |
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【摘要】 目的 检测非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）、癌旁组织及肺良性病变组织中垂体瘤转化基因（pituitary tumor transforming gene,PTTG）及血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor，VEGFC)的表达和微淋巴管密度(lymphatic microvessel density，LMVD)值，并探讨三者间的相互关系。方法 应用实时荧光定量 PCR 和免疫组织化学方法检测非小细胞肺癌组织中 PTTG、VEGFC mRNA 和蛋白及 LMVD 的表达，分析 PTTG、VEGFC 及 LMVD 与 NSCLC 临床病理特征的关系，以及 PTTG、VEGFC 和 LMVD 三者之间的相互关系。同时，对随访资料进行生存分析，绘制生存率曲线，探讨 PTTG、VEGFC 对肺癌患者预后的影响。结果 PTTG、VEGFC mRNA 和 LMVD 值在不同性质的肺病变组织中的表达均有显著性差异(P均＜005)，在不同年龄、性别、是否吸烟、肿瘤大小、组织学类型及分化程度间无显著性差异(P均＞005)，在TNM分期、淋巴结转移与否及预后组间有显著性差异(P均＜005)。PTTG、VEGFC 蛋白表达在淋巴结转移与否及预后组间有显著性差异(P均＜005)。生存率曲线显示 PTTG、VEGFC 高表达者生存时间均短于低/无表达者(P=0030，0027，n=65)。PTTG 在肺癌组织中的表达与 VEGFC、LMVD 密切相关，随着 PTTG 强度增加，VEGFC 分级及 LMVD 值亦增加。结论 PTTG、VEGFC 的过度表达促使肿瘤微淋巴管的生成，进而促进了肿瘤细胞淋巴结转移。PTTG 和 VEGFC 表达可作为判断 NSCLC 生物学行为及肺癌患者预后的良好指标，VEGFC 有望成为肺癌抗淋巴管治疗的新靶点。 【关键词】 垂体瘤转化基因；血管内皮生长因子C；微淋巴管密度；实时荧光定量PCR 垂体瘤转化基因(PTTG)是1997年〔1〕 被发现并证实与细胞增殖、分化和凋亡有关的癌基因。血管内皮生长因子(VEGF)C 被认为是迄今发现的唯一特异性新生淋巴管刺激因子,可促进肿瘤微淋巴管生成及肿瘤细胞向区域淋巴结转移。有研究〔2〕 显示 PTTG 可通过促进 VEGFC 的过度表达，促使肿瘤细胞发生淋巴结转移。国内外已报道 PTTG 在食管癌、胃癌和卵巢癌等多种肿瘤中高表达，但目前尚未见对 PTTG 在肺癌中表达研究的报道。以往关于 VEGFC 的研究多为蛋白半定量分析，本实验结合免疫组化应用实时荧光定量 PCR 对非小细胞肺癌(NSCLC)组织中 PTTG、VEGFC 的表达进行精确定量分析，并检测微淋巴管密度(LMVD)的表达情况,旨在探讨它们与 NSCLC 临床病理特征及预后的关系。 1 材料与方法 11 研究对象 收集65例 NSCLC 组织，均来自手术切除且经病理科常规病理学检查证实。男∶女为40∶25，年龄43～78（中位数588）岁。依据1997年新的修订标准进行TNM分期，其中Ⅰ期7例，Ⅱ期28例，Ⅲ期26例，Ⅳ期4例；按病理形态学分为鳞状细胞癌36例，腺癌26例，大细胞癌3例；按分化程度分为高分化5例，中分化18例，低分化42例；按有无淋巴结转移分为有淋巴结转移37例，无淋巴结转移28例。所有患者均为原发性 NSCLC，术前均未接受过化疗或放疗等任何治疗。同时取65例配对的癌旁组织和20例肺良性瘤样病变组织(包括结核球10例，错构瘤4例，炎性假瘤4例，肺纤维组织细胞瘤1例，肺隐球菌感染1例)。癌旁组织为距肿块边缘5 cm以上的正常组织。肺癌组织和肺良性病变组织均取自肿块中央非坏死部分。标本经10％甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋。65例患者无住院期间死亡，随访日期以患者手术日期起计算，术后随访至2006年5月。 12 实验用品 RNAiso Reagent、SYBR ExScriptTM RTPCR Kit(DRR053S) 均购自TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其他各种化学试剂均为进口或国产分析纯。采用ABI PRISM 7000 实时 PCR扩增仪。兔抗人多克隆抗体 PTTG、VEGFC、VEGFR3及免疫组织化学试剂盒PV9000均购自北京中山生物技术公司。 13 实验方法 131 实时荧光定量 1311 总RNA的提取 每100 mg组织匀浆后，加入TRIzol Reagent 1 ml，然后加入02 ml氯仿，离心后吸取上清，加入05 ml异丙醇，离心沉淀后弃上清，75% 乙醇洗沉淀，DNase Ⅰ酶解可能残余的基因组DNA。RNA 溶于DEPC 水，甲醛变性凝胶电泳，分光光度计检测浓度和纯度。 1312 cDNA的合成 反转录仪为 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems公司)。采用10 μl反转录反应体系，4μl 溶解于去RNA酶的双蒸水，05μl 随机引物（100 μmol），2 μl 5×ExSciptTM Buffer，025μl ExSciptTMRTase（200 U/μl），025 μl RNA酶抑制剂（40 U/μl），05μl dNTP 混合物(各10 mmol)，加去RNA酶的蒸馏水至10μl。反应条件：42 ℃15 min（反转录反应）；95℃2 min（反转录酶的失活反应）。 1313 荧光定量PCR扩增 引物：由TaKaRa公司提供的高特异性引物, PPTG 上游引物序列5′CCTCAGATGAATGCGGCTGTTA3′，下游引物序列5′AGCTTCAGCCCATCCTTAGCAA3′，扩增片段为118 bp。VEGFC 上游引物序列5′CAGCACGAGCTACCTCAGCAAG3′，下游引物序列5′TTTAGACATGCATCGGCAGGAA3′，扩增片段为115 bp。荧光定量 PCR 仪为ABI PRISM 7000实时PCR扩增仪(Applied Biosystems公司)，用荧光染料SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法进行PCR扩增。采用20 μl反应体系，包括2 μl cDNA溶液，特异性上下游引物各04 μl（10 μmol），04 μl ROX 参照染色(50×)，SYBR Premix Ex TaqTM (2×)10μl，dd H2O(灭菌蒸馏水)68 μl。采用两步法 PCR 扩增标准程序：预变性95 ℃10 s；PCR反应95℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40个循环,历时1 h 37min。 1314 数据收集处理和分析 荧光定量 PCR 结果用7000 序列检测系统软件输出Ct值，参照2ΔΔCt 数据分析法〔3〕进行相对定量计算。 132 免疫组化法 1321 检测 PTTG、VEGFC 蛋白表达 采用免疫组化 Wax Envision 多聚复合物酶标法，具体步骤按照试剂盒说明书进行。阴性对照采用001 mol／L PBS代替一抗。 1322 结果判定 参照 Vlom 等〔4〕 的评判标准：PTTG、VEGFC 蛋白染色阳性为胞浆呈清晰棕黄色颗粒，每张 PTTG 切片在400倍显微镜下选定l0个视野，计算阳性细胞的百分数，胞浆染色阳性的细胞百分率 ＜5％ 为“-”，5％～24％ 为“+”，25％～50％ 为“”，＞50％ 为“”。VEGFC 切片以400倍视野下着色细胞占视野细胞总数的多少分为0～3级：0级，0；1级，＜25％；2级，26％～50％；3级，＞50％。0级为阴性，1级或1级以上为阳性。 1323 LMVD 计数方法参照Weidner 等〔5〕的标准 先在光镜低倍(×40)视野下寻找癌周组织微淋巴管最密集区即热点(hotspot)，然后在100倍视野下观察着色的管腔及细胞丛，并以此作为一个微淋巴管。一张切片计数3～5个 100倍视野内的淋巴管数，取其平均值为微淋巴管数。 1324 生存分析 通过绘制生存率曲线显示 PTTG、VEGFC 高表达者与低/无表达者生存时间的差别。 14 统计学分析 应用SPSS130软件包。计量资料采用t检验、单因素方差分析和q检验，计数资料采用χ2检验及多个独立样本秩和检验(Kruska1Wallis Test)。对生存数据采用 KaplanMeier 分析并绘制生存曲线，用Logrank检验差异性。 2 结 果 21 PTTG、VEGFC mRNA 和LMVD在肺癌组织、癌旁组织和肺良性病变组织中的表达PTTG、VEGFC mRNA 和 LMVD 值在不同性质的肺病变组织中的表达均有显著性差异(P均＜005)（表1）。 表1 不同性质的肺病变组织中 PTTG、VEGFC 的表达及 LMVD 值(略) 22 PTTG 和 VEGFC 蛋白在 NSCLC 中的表达及其与淋巴结转移和预后的关系 PTTG、VEGFC 蛋白表达在淋巴结转移与否及预后组间有显著性差异(P均＜005)(表2)。生存率曲线显示 PTTG、VEGFC 高表达者生存时间均短于低/无表达者(P=0030，0027，n=65)（表3、图1）。表2 PTTG、VEGFC 蛋白在 NSCLC 中的表达及其与淋巴结转移、预后的关系(略)表3 NSCLC 中 PTTG 和 VEGFC 表达与术后生存期的关系（略） 23 PTTG、VEGFC mRNA 和 LMVD 在 NSCLC 中的表达及其与临床病理特征和预后的关系 PTTG、VEGFC mRNA 和 LMVD 在不同年龄、性别、是否吸烟、肿瘤大小、组织学类型及分化程度间无显著性差异(均P＞005)，在TNM分期、淋巴结转移与否及预后组间有显著性差异(均P＜005)(表4)。表4 PTTG、VEGFC mRNA 及 LMVD 在 NSCLC 中的表达及其与临床病理特征和预后的关系(略) 24 肺癌组织中 PTTG 蛋白表达与 VEGFC 及 LMVD 的关系 PTTG(-)、(+)、()、()中 LMVD 的均值分别为(1863±155)、(2174±141)、(2407±182)和(2617±334)，运用单因素方差分析得 LMVD 值之间有差异性 (P＜005)，PTTG 和 LMVD 呈正相关关系。随着 PTTG 表达强度的增加 VEGFC 阳性分级随之上升，LMVD 均值也逐渐增加，LMVD 均值的增加是与 PTTG 阳性强度平行的，即 PTTG 表达越强,LMVD 均值越高,PTTG 与 VEGFC、LMVD 之间呈显著相关性（表5，图2）。表5 肺癌组织中 PTTG与 VEGFC 表达的相互关系（略） 3 讨 论 31 PTTG 和 VEGFC 在 NSCLC 组织中的表达及其意义 PTTG 是一种强有力的肿瘤转化基因,在没有其他辅助癌基因参与下即能引起细胞转化,与大多数肿瘤的发生有密切关系。它除在胚胎肝、睾丸和胸腺中高表达外，大多数成人正常组织中,只有弱表达甚至不表达，而在大多数肿瘤细胞和肿瘤细胞系中 PTTG 却呈明显高表达〔6〕 。因其表达具有肿瘤特异性，所以被认为是一种极具潜在价值的肿瘤标记物，有望成为肿瘤治疗的新靶点。研究发现〔2〕 垂体肿瘤中 VEGF 及其受体 KDR/FIK1 含量比正常垂体组织显著升高,它们的含量与 PTTG 表达量呈正相关。推测 PTTG 过度表达通过上调生长因子受体,从而刺激 VEGF 表达,促进垂体肿瘤新生血管和淋巴管生成,进而加速肿瘤生长、浸润和转移。 肺癌侵袭、转移依赖于肿瘤局部血管生成的理论已经得到证实，而事实上它似乎更易于经淋巴道转移。由于缺乏明确的淋巴管生成因子和标记因子，对淋巴转移的研究进展缓慢。VEGFC 是迄今发现的惟一特异淋巴管内皮细胞刺激因子，属于VEGF 家族,在人类基因定位于染色体4q34。它通过特异性地激活淋巴管内皮上的受体 VEGFR3（Flt4），导致受体 VEGFR3 酪氨酸磷酸化,诱导微淋巴管的生成并影响淋巴管内皮的通透性,从而促进肿瘤转移〔7〕 。研究发现多种肿瘤细胞表达 VEGFC。Kabashima 等〔8〕 通过检测胃癌组织中 VEGFC 的表达,发现其与胃癌的淋巴管浸润、转移密切相关。Valtola 等〔9〕 对乳腺癌的研究结果显示,VEGFC 阳性表达者的淋巴结转移率和死亡率均高于阴性表达者。 本实验实时荧光定量 PCR 检测结果显示 PTTG、VEGFC mRNA 在肺癌组织中的表达强度明显高于癌旁组织和肺良性病变组织。值得注意的是癌旁组织中 PTTG 只呈现弱表达，且肺良性病变组织中几乎无 PTTG 表达(P均＜005)。提示该基因可能通过促进正常肺组织细胞癌变而对肺癌的发生、发展起重要作用。至于在癌旁组织中弱表达的 PTTG 的作用机制是同癌组织中表现的分子机制相同，还是有其独特的表达机制，有待进一步研究。而阐明 PTTG 在癌旁组织中的表达机制将有助于 NSCLC 癌变机制的研究，同时也可为肺癌早期诊断、早期癌变细胞逆转和预防肿瘤细胞的形成提供理论依据。 研究发现 PTTG、VEGFC mRNA 在不同年龄、性别、是否吸烟、肿瘤大小、组织学类型及分化程度间无显著性差异(P均＞005)，提示 PTTG、VEGFC 对促进肺癌的发生、发展可能具有普遍意义。这和临床上肿瘤的大小、病理类型及分化程度与肿瘤侵袭、转移密切相关的观点相矛盾，可能的解释是肺癌的发生、发展是多基因、多阶段和多途径相互作用的结果。PTTG、VEGFC mRNA 在TNM分期、淋巴结转移与否和预后组间有显著性差异(P均＜005)。免疫组化结果亦显示 PTTG 和 VEGFC 蛋白表达与肿瘤的淋巴结转移及预后密切相关(P均＜005)，进一步从蛋白质水平证明了PTTG和VEGFC表达增强可能是肺组织癌变及浸润演进过程中的重要因素,并可能是 NSCLC 发生转移和预后不良的分子标志之一。生存率曲线显示 PTTG 和 VEGFC 高表达者生存时间均短于低/无表达者(P=0030，0027，n=65)。提示 PTTG 和 VEGFC 表达可作为判断 NSCLC 生物学行为及肺癌患者预后的良好指标。 32 PTTG、VEGFC 和 LMVD 在 NSCLC组织中表达的相互关系及其临床意义 本实验中肺癌组织与癌旁组织、癌旁组织与肺良性病变组织、肺癌与肺良性病变组织间 LMVD 值均具有显著性差异(P均＜005)，提示微淋巴管的生成增加在肺癌的发生、发展中发挥着重要作用。特别是 LMVD 值与较晚的临床病理分期、淋巴结转移及预后密切相关(P均＜005)，进一步提示中晚期肺癌患者往往手术预后不佳，除了与肺癌本身特有的生物学活性及发展规律有关外，微淋巴管的大量生成可能是肺癌后期侵袭、转移进程中的主要因素。 已知 PTTG 蛋白具有反式激活作用,VEGFC 是其靶基因〔2〕 ,VEGF-C 可能作为 PTTG 介导微淋巴管生成行为的效应剂来发挥作用。He 等〔10〕 研究表明 VEGFC 可使淋巴内皮在肿瘤细胞密集区内大量增生，并促进淋巴管扩张，且新生的微淋巴管结构并不完善,处于高渗漏状态,有利于肿瘤细胞进入淋巴管发生转移。本研究发现 PTTG 蛋白阳性的肺癌组织 LMVD 值也较高，推测可能是 PTTG 蛋白激活了 VEGFC 蛋白的表达,而后者促进微淋巴管内皮细胞分裂,降解基底膜刺激内皮细胞向肿瘤组织内趋化运动,形成新生微淋巴管。新生微淋巴管为肿瘤组织提供营养并排除代谢产物,促进肿瘤的生长。 我们通过对肺癌组织中 PTTG、VEGFC 蛋白表达和 LMVD 值相互关系的研究，发现随着 PTTG 表达强度的增加 VEGFC 阳性分级随之上升，LMVD 均值也逐渐增加，LMVD 均值的增加是与 PTTG 阳性强度平行的，即 PTTG 表达越强,LMVD 均值越高,PTTG 与 VEGFC、LMVD之间呈显著相关性。进一步证明了 PTTG 和 VEGFC 在肺癌发生侵袭、浸润和淋巴结转移过程中发挥着协同促进作用。目前，VEGFC 已成为肿瘤抗淋巴管治疗的新靶点和热点。Roberts 等〔11〕 研究发现特异性 VEGFR3 抗体能有效抑制 VEGFR3 的活性，从而抑制肿瘤细胞局部和远处淋巴结转移。Chen等〔12〕 把载体介导的小干扰RNA(siRNA)转入小鼠乳腺中，形成基因沉默复合物，发现乳腺癌的淋巴结转移率明显降低且小鼠的生存期也得到延长。Lin 等〔13〕 在研究前列腺癌淋巴结转移时发现利用重组腺病毒诱导载体携带着可溶性 VEGFR3 免疫球蛋白可有效抑制前列腺癌淋巴结转移。上述研究均表明通过抑制 VEGFC/VEGFR3 的活性可达到抗肿瘤细胞淋巴结转移的目的。本研究结果显示肺癌组织中 VEGFC 呈高表达，故寻找有效的肺癌抗淋巴管治疗方法及探明其作用机制将是以后 VEGFC 研究的重点。 【参考文献】 1 Pei L, Melmed S Isolation and characterization of a pituitarytumor transforming gene(PTTG)〔J〕Mol Endocrinol,1997；11(4):43341 2 McCabe CJ, Boelaert K, Tannahill LA,et al Vascular endothelial growth factor, its receptor KDR/Flk1,and pituitary tumor transforming gene in pituitary tumors〔J〕Clin Endocrinol Metab，2002；87(9):423844 3 Kenneth J，Livak, Thomas D，et al Analysis of relative gene expression data using RealTime Quantitative PCR and the 2ΔΔCt method〔J〕Methods, 2001;25:4028 4 Vlom M，Koomagi R，Mattren JPrognostic value of vascularendothelial growth factor and its receptor Fltl in squamous celllung cancer〔J〕Int J Cancer，1997;74(1)：648 5 Weidner NIntratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer〔J〕 Am J Pathol，1995;147(1)：919 6 Zhang X, Horwitz GA, Prezant TR,et al Structure, expression and function of human pituitary tumortransforming gene(PTTG)〔J〕Mol Endocrinol,1999;13:15666 7 David G New molecular markers for the study of tumor lymph angiogenesis〔J〕Anticancer Res,2001;21(9):4279 8 Kabashima A, Maehara Y, Kakeji Y,et al Overexpression of vascular endothelial growth factor C is related to hypogenous metastasis in early gastric carcinoma〔J〕Oncology,2001;60(2):146 9 Valtola R, Salven P, Helkkila P, et alVEGFR3 and its ligand VEGFC are associated with angiogenesis in breast cancer〔J〕Am J Pathol,1999;154(5):1381 10 He Y,Rajantie I,Pajusola K,et al Vascular endothelial cell growth factor receptor 3mediated activation of lymphatic endothelium is crucial for tumor cell entry and spread via lymphatic vessels〔J〕Cancer Res，2005;65(11):473946 11 Roberts N, Kloos B,Cassella M,et al Inhibition of VEGFR3 activation with the antagonistic antibody more potently suppresses lymph node and distant metastases than inactivation of VEGFR2〔J〕Cancer Res，2006;66(5):26507 12 Chen Z,Varney ML,Backora MW,et al Downregulation of vascular endothelial cell growth factorC expression using 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