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反义bcl           ★★★ 【字体：小 大】
反义bcl
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-1    
作者：葛正龙，范芳，李长福，李海祥，曾小平
【关键词】  基因
    Effect of antisense oligodeoxynucleotide bcl2 on expression of Bcl2 protein and cell cycle of lens epithelial cells induced by galactose
　　【Abstract】 AIM:  To investigate the effect of antisense oligodeoxynucleotide bcl2  (bcl2  ASODN) on the expression of Bcl2 protein and the cell cycle of rabbit lens epithelial cells（LECs）induced by galactose. METHODS:  From translation initiation region of bcl2 gene, oligonucleotides were synthesized and modified with phosphorothioate. Rabbit lens were treated with galactose and bcl2  ASODN. The influence of bcl2  ASODN on the level of Bcl2 protein expression and the cell cycle of LECs induced by galactose was detected by flow cytometry. RESULTS:  5.0-15.0μmol/L of bcl2  ASODN reduced the level of Bcl2 protein expression on LECs induced by galactose, with the fluorescence intensity decreasing from 158.70±2.14 to 113.94±2.88, and decreased the number of S phase cells of Lens from 20.60% to. 0.67%. CONCLUSION:  bcl2  ASODN can inhibit the level of Bcl2 protein expression on LECs induced by galactose, interfere the entry of LECs into the S phase and inhibit the proliferation of LECs.
　　【Keywords】  genes, bcl2; oligonucleotides, antisense; galactose; lens, crystalline/cytology
　　【摘要】 目的： 探讨反义bcl2 寡核苷酸(bcl2  ASODN)对半乳糖诱导的兔晶状体中Bcl2蛋白表达及细胞周期的影响.  方法： 人工合成与bcl2基因翻译起始区序列互补的寡核苷酸并磷酸化修饰，用半乳糖和bcl2  ASODN处理体外培养的兔晶状体，流式细胞术检测bcl2  ASODN对半乳糖诱导的LEC中Bcl2蛋白表达水平及细胞周期的影响.  结果： 5.0 ~15.0 μmol/L反义bcl2 寡核苷酸能下调半乳糖诱导的晶状体上皮细胞中Bcl2蛋白的表达，荧光强度从158.70±2.14降至113.94±2.88，同时可降低S期细胞数，从20.60%降至0.67%. 结论： bcl2  ASODN能抑制半乳糖诱导的晶状体中Bcl2蛋白的表达水平，阻止细胞进入S期，抑制细胞增殖.
　　【关键词】  基因，bcl2 ；寡核苷酸类，反义；半乳糖；晶体/细胞学
　　0引言
　　近年的研究表明，一些癌基因的异常表达与晶状体上皮细胞（lens epithelial cells, LEC）的增殖和分化密切相关，bcl2基因是一种与细胞增殖、分化和凋亡密切相关的原癌基因，研究认为LEC的增殖与bcl2基因的表达有关［1］，而bcl2的过度表达能诱导转基因鼠白内障的形成. 为了探讨白内障的发病机制及反义bcl2寡核苷酸片段对半乳糖性白内障治疗的可行性，我们通过导入bcl2  ASODN，观察其对半乳糖诱导的晶状体中Bcl2蛋白表达及细胞周期的影响，现报道如下.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　反义寡核苷酸的制备：根据bcl2基因翻译起始区序列设计ASODN，碱基序列如下［2］：  5′AGCGTCCGCCATCCTTCC3′ （由上海Sangong公司合成，两端各硫代修饰3个碱基）. 使用前加消毒双蒸水溶解，配成浓度为61.6 μmol/L的原液，于95℃水浴变性5 min，冰上骤冷备用. 临用前用DMEM培养液稀释成相应浓度使用.
　　1.2方法
 
　　1.2.1晶状体组织培养取4~6 wk白色无眼疾家兔，雌雄不拘，体质量0.4~0.75 kg，耳缘静脉空气栓塞处死，立即按常规无菌操作摘除眼球，1∶1000庆大霉素生理盐水冲洗干净，在超净台内剪去角膜和虹膜，用眼科无齿镊小心取出完整晶状体放入含DMEM完全培养基的24孔培养板中，每孔放置1枚晶状体，37℃, 50 mL/L CO2条件下培养，2 d后取出观察，除去在剥取过程中受损的晶状体，选择完好透明的晶状体待用.
　　1.2.2实验分组培养晶状体组织加入无血清培养基使细胞同步化，继续培养24 h后换用含50 mL/L FBS的DMEM培养基，实验分为3大组，第1组为正常对照组，只加培养基（含50 mL/L FBS）；第2组为半乳糖组，加含30 mmol/L半乳糖的培养基；第3组为bcl2  ASODN组，培养基（含30 mmol/L半乳糖）中bcl2  ASODN终浓度分别为5.0, 10.0, 15.0 μmol/L. 每组设6个平行组，取平均值.
　　1.2.3流式细胞仪检测Bcl2蛋白的变化上述各组晶状体组织培养24 h后取出，分离晶状体前囊膜，剪碎，细胞分离机分离后800 r/min离心8 min，弃上清（去掉组织碎片），加PBS 2 mL振荡混匀制成单细胞悬液，10 g/L多聚甲醛室温固定， 1500 r/min离心8 min，弃固定液，细胞重悬于5 mL/L Triton X100 1 mL中，37℃水浴30 min，以增加细胞膜通透性并封闭非特异性抗原，离心，沉淀分别按组加入100 μL一抗（bcl2 多克隆抗体），另设一组以100 μL PBS代替一抗作为上机时的空白对照组，室温放置30    min后离心，冷PBS洗涤2~3次，加FITC标记的二抗100 μL，避光放置30  min；冷PBS洗涤去除未结合的多余荧光抗体，离心后沉淀加500 μL PBS上机检测. 每份样本采集细胞2×105个，以平均荧光强度表示蛋白质含量. 通过流式细胞仪观察bcl2  ASODN对高糖条件下晶状体上皮细胞中bcl2基因表达水平的影响.
　　1.2.4流式细胞仪检测细胞周期的变化培养晶状体分组同上，培养24 h后取出晶状体，剪碎，用细胞分离机制备单细胞悬液，PBS洗涤后加碘化丙啶（PI，终浓度50 mg/L）1 mL ，4℃避光2 h后流式细胞仪检测bcl2  ASODN对高糖条件下LEC细胞周期的影响.
　　统计学处理： 以x±s表示实验数据，采用SPSS软件（10.0版本）进行方差分析，方差齐的两两比较用LSD法，方差不齐的两两比较用Dunnett T3法，P<0.05表示有显著性差异.
　2结果
　　2.1bcl2  ASODN对高糖诱导的晶状体中bcl2基因表达的抑制作用通过FACS流式细胞仪检测bcl2  ASODN对高糖条件下培养的晶状体中bcl2基因表达的影响，以平均荧光强度表示蛋白的相对含量. 结果显示半乳糖能诱导LEC中bcl2基因表达增强，其荧光强度为对照组的1.57倍（P<0.05）. 半乳糖诱导的晶状体经bcl2  ASODN处理24   h后，ASODN浓度从5.0～15.0 μmol/L均有抑制作用，随浓度增大而抑制作用增强，与半乳糖组相比均有显著性差异（P<0.05）. 结果说明ASODN能下调bcl2基因的表达（Tab 1, Fig 1）. 表1bcl2  ASODN对晶状体上皮细胞中bcl2基因表达和细胞周期的影响（略）
　　2.2bcl2 ASODN对细胞周期的影响流式细胞术能迅速分析细胞群中各细胞周期时相的组成，其中S期百分率常作为比较细胞增殖活性的指标. 在晶状体中加入半乳糖后，S期细胞数由0.3%急剧增加至20.6%，提示半乳糖能诱导LEC进入S期. 导入bcl2  ASODN后，随ASODN浓度增加（5.0～15.0 μmol/L）S期细胞数明显减少（Tab 1）.
　　3讨论
　　癌基因是一类与细胞的增殖分化密切相关的基因，目前对癌基因的研究已扩展到非肿瘤领域. 与白内障的发生发展有关的癌基因有bcl2、cmyc、cfos等. bcl2基因是1984年Tsjimoto等从B细胞滤泡性淋巴瘤染色体断裂点发现的凋亡抑制基因，它可以使细胞寿命延长、生长失去平衡，造成细胞数目增多［3］. 研究表明LEC的增殖与bcl2基因的表达有关［1］，其过度表达能诱导转基因鼠白内障的形成，提示bcl2基因是白内障发生发展过程中的关键基因，而抑制bcl2基因的异常表达是阻断白内障发生发展的一个有效途径.
 　　
　　随着细胞生物学、分子生物学的蓬勃发展，对白内障发病机制的研究已深入到分子水平. 作为一种新的可能的治疗手段，基因治疗日益受到人们的关注. 反义寡核苷酸（ASODN）是能与特异的mRNA或DNA互补结合并抑制其转录和翻译的一段寡核苷酸链，具有封闭（抑制）特定基因表达的作用，ASODN治疗已成为近年发展起来的基因治疗的一项重要技术. 我们已成功将bcl2  ASODN、cmyc ASOND导入高糖诱导的LEC中，并观察到bcl2  ASODN能抑制半乳糖诱导的晶状体上皮细胞的增殖，而cmyc ASODN对cmyc基因表达及细胞增殖均有抑制作用［4,5］.
     
　　鉴于此，为了继续探讨bcl2基因在白内障发生发展中的作用，研究bcl2  ASODN对高糖条件下晶状体上皮细胞的影响，本研究合成了与bcl2基因翻译起始区序列互补的反义寡核苷酸，利用流式细胞仪观察其对半乳糖诱导的晶状体上皮细胞中bcl2基因表达及细胞周期的影响. 结果显示，在培养基中加入30 mmol/L半乳糖后，bcl2基因表达增强. 导入5.0 ~15.0 μmol/L bcl2  ASODN作用24 h后，bcl2  ASODN对晶状体中bcl2基因表达均有抑制作用，且浓度增大而抑制作用增强. 实验结果表明bcl2基因的高表达可能是半乳糖性白内障形成过程中的一个早期变化，一定浓度的bcl2  ASODN能下调bcl2基因的表达.
　　
　　我们还通过流式细胞仪（FCM）观察了bcl2  ASODN对细胞周期的影响，显示LEC正常情况下大多处于静息状态（G0G1期细胞占91.16%，S期细胞仅有0.30%）. 在LEC中加入半乳糖后，由G0G1期进入S期的细胞明显增多，S期细胞数由0.30%急剧增加至20.60%，此时细胞增殖活跃，这也许是bcl2基因在半乳糖诱导下高表达的诱因之一. 导入bcl2  ASODN后，S期细胞数明显减少，随ASODN浓度增加（2.5～15.0 μmol/L）S期细胞数有减少趋势（1.87%～0.67%）. 进一步说明bcl2基因和cmyc基因可能是LEC增殖分化及白内障发生发展过程中的关键基因. 通过反义寡核苷酸可抑制其基因表达，影响细胞的增殖分化，这对阻断半乳糖性白内障的发生发展及逆转白内障具有重要意义. 而bcl2基因和cmyc基因在白内障的发生发展中的相互关系还有待进一步研究.
　　【参考文献】
　　［1］ 翁景宁，张惠蓉.  bcl2 基因和增殖细胞核抗原在人晶状体上皮细胞中的表达［J］. 中华眼科杂志,2001；37（3）：197-199.
  
　　Weng JN, Zhang HR. The characteristics of bcl2  and PCNA expression in the lens epithelium of human being    ［J］. Chin J Ophthalmol,  2001；37（3）：197-199.
　　［2］ 雷小勇，张洹，林剑. 一个新的靶点的反义bcl2 寡核苷酸诱导HL60细胞凋亡的研究. 暨南大学学报（自然科学版）.2001；22（1）：125-128.Lei XY, Zhang Y, Lin J. Induction of apoptosis in HL60 cells by a new antisense oligodeoxynucleotide targeting for the bcl2  coding sequences ［J］. 　J  Jinan Univ (Natural  science), 2001；22（1）：125-128.
　　［3］ Graninger WB, Seto M, Boutain B, et al. Expression of Bcl2 and Bcl21g fusiun transcripts innormal and neoplastic cells［J］. J Clin Invest, 1987;80(5):1512-1515.
　　［4］ 李长福，范芳，葛正龙，等. 反义bcl2 寡核苷酸对半乳糖诱导的晶体上皮细胞的抑制作用［J］. 第四军医大学学报,2004；25（5）：395-397.
 
　　Li Changfu, Fan Fang, Ge Zhenglong, et al. Effects of antisense oligodeoxynucleotide cmyc on expression of cMyc protein and cell cycle of lens epithelial cells induced by galactose［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004；25（5）：395-397.
　　［5］ 范芳，葛正龙，李长福，等. cmyc ASODN对半乳糖诱导的晶体上皮细胞中cMyc蛋白表达及细胞周期的影响［J］. 第四军医大学学报. 2004；25（11）：961-963
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