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胃癌组织中DNA聚合酶β基因突变特点分析           ★★★ 【字体：小 大】
胃癌组织中DNA聚合酶β基因突变特点分析
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-1    
作者：赵洁，董子明，毛海洲，王煊，赵国强 
【关键词】  ,DNA聚合酶β
    Mutation characteristics of DNA polymerase beta gene in human gastric carcinoma tissue
　　【Abstract】 AIM: To detect the mutation characteristics of DNA polymerase beta gene (polβ gene) in human gastric carcinoma. METHODS:  Total RNA was extracted from 32 gastric cancer samples and 32 tissue samples adjacent to tumors. The RTPCR was carried out and the PCR product was cloned and sequenced with Sangers method subsequently. RESULTS:  Three from the seven abnormal SSCP samples were sequenced and the mutation sites were: site 196 A→G, site 268 A→G and site 790 A→T. No mutation was found by sequencing in a normal PCRSSCP sample of the tissues adjacent to the tumor. Omiga analysis showed that the three point mutations led to changes of amino acid: site 196 A→G of nucleic acid resulted in site 28 Asn→Ser of amino acid, site 268 A→G of nucleic acid resulted in site 52 Lys→Arg of amino acid, and site 790 A→T of nucleic acid resulted in site 226 Asp→Val of amino acid. Choufasman method of Dnasis showed that site 196 A→G mutation caused great changes in the secondary structure of polβenzyme. CONCLUSION:  The polβgene mutation rate is up to 21.9%. The three point mutations observed in this study all lead to the alternation of amino acid. Site 196 A→G mutation can cause great changes in the secondary structure of polβ enzyme.
　　【Keywords】 DNA polymerase beta; gene mutation; stomach neoplasms
　　【摘要】 目的：探讨人胃癌DNA聚合酶β(polβ)基因突变的特点. 方法：对32例人胃癌组织及32例正常对照组织中提取总RNA，进行RTPCR，SSCP，对PCR产物克隆后以Sangers法测序，并采用Omiga及Dansis软件分析结果. 结果：人胃癌标本的polβ基因突变率21.9%. 测序分析了7例SSCP异常中的3例，其突变分别为196位A→G，268位A→G，790位A→T；经OMIGA软件分析，这3个polβ的点突变均导致了氨基酸的改变，具体形式为：核酸196位A→G导致氨基酸28位Asn→Ser；核酸268位A→G导致氨基酸52位Lys→Arg；核酸790位A→T导致氨基酸226位Asp→Val. DNASIS软件Choufasman算法推测，polβ的196位A→G突变可以导致polβ酶蛋白的二级结构图明显改变. 结论：人胃癌组织polβ基因突变率达21.9%；这3个polβ的点突变都导致了氨基酸的改变，196位A→G突变可以导致polβ酶蛋白的二级结构明显改变.
　　【关键词】 DNA聚合酶β；基因突变；胃肿瘤
　　0引言
　　DNA 聚合酶β(polβ)为真核生物中5种DNA聚合酶之一,是一重要的碱基切除修复(BER)酶,有利于维持基因组的稳定性. 有关DNA修复酶基因的表达及突变和遗传性微卫星不稳定性及与基因突变途径的关系已为肿瘤分子机制的深入研究提供了一个新领域［1-3］. 我们研究人胃癌组织中polβ基因突变位点及对应氨基酸、蛋白质二级结构的改变，探讨其在胃癌发生中的作用.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　胃癌及癌旁组织标本32例，取自济南军区第155中心医院、郑州大学第一医院、河南省人民医院胃镜室，经病理检查确诊为胃癌. 每份标本取自癌组织和癌旁正常组织各3块,标本离体后迅速置于-196℃液氮保存.
　　1.2方法
　　应用Qiagen公司总RNA提取试剂盒提取总RNA,AMV 42℃反转录合成cDNA；用polβ SSCP引物进行PCR扩增，扩增出polβ的7个基因片段；将PCR扩增产物进行SSCP分析，筛选出突变基因序列；以全基因引物扩增在SSCP中被发现的异常标本的polβ基因完整DNA序列；选择pGEMT为载体，用T4 DNA连接酶连接目的基因polβ和质粒DNA；选用E.coli JM109为宿主菌，用氯化钙共沉淀法制备感受态细胞并将重组体转入宿主菌. 在用插入灭活法和蓝白筛选下得到阳性克隆（pGEMTpolβ）；使用T7/SP6引物扩增方法鉴定重组体；提取重组质粒（pGEMTpolβ）进行DNA序列测定；得到序列用DNASIS，Omiga软件与GenBank中查到的DNA聚合酶β基因序列进行同源性比较分析，推测其蛋白序列并分析蛋白同源性及结构改变情况.
　2结果
　　在32例胃癌组织标本中有7例SSCP异常，突变率为21.9%. 而对应的32例癌旁组织PCRSSCP结果中未见异常. 对7例SSCP异常中的3例进行DNA测序,与GenBank中查到的polβ基因进行同源比较和分析,结果发现,polβ基因的第790位由A变为T,突变类型为颠换 ,第268位由A变为G，突变形式为转换，第196位由A变为G，突变形式为转换. 经Omiga软件分析，推测polβ各变异位点对应的氨基酸的变异情况(Tab 1). 应用ASIS软件ChouFasman算法推测polβ氨基酸序列二级结构结果(Fig 1).表1polβ各变异位点对应的氨基酸变异情况（略）
　　3讨论
　　细胞DNA损伤与肿瘤的发生有密切关系. polβ是一重要的DNA修复酶,其突变与一些肿瘤的发生有关. 在结直肠癌、膀胱癌、前列腺癌和食管癌等中检测到的polβ基因突变［4-7］和本实验中检测到胃癌的polβ基因突变的形式和部位均不相同，突变率也有差异. 本组32例癌组织标本中突变率为21.9%，突变形式仅有点突变一种，不存在polβ基因缺失的现象. 推断：polβ突变率，结直肠癌＞食管癌＞胃癌. 在胃癌中polβ突变的研究中发现，178位T→C（22Leu→Pro）,828位T→C（239Cys→Arg）,229位A→G（39Tyr→Cys）,591位G→A（160Asp→Asn）,993位A→G（294Asn→Asp）,996位G→A（295Glu→Lys）等点突变，并且指出996位G→A是胃癌中polβ突变的相对热点. 我们发现的polβ的突变位点与日本学者Iwanaga等［8］不同，从我们的结果似乎不支持996位G→A是胃癌中polβ突变的相对热点.
　　【参考文献】
　　［1］ Li B，Lee MY. Transcriptional regulation of the human DNA polymerase δ catalytic subunit gene pold1 by p53 tumor suppressor and Sp1 ［J］. Biol Chem, 2001;276(8):29729-29739.
　　［2］ 白飞虎，郭新宁，杨力,等. 人胃癌裸鼠胃原位移植转移模型的建立［J］. 第四军医大学学报，2003；24(10): 873-875.
　　Bai FH, Guo XN, Yang L, et al. Establishment of transplantation of in situ human gastric tumor metastasis model in nude mice［J］. J Fourth Mil Med Univ,2003;24(10):873-875.
　　［3］ 蔡永国，房殿春，杨仕明，等. 胃癌组织中肝素酶mRNA的表达意义［J］. 第四军医大学学报,2004;25(10):909-911.
　Cai YG, Fang DC, Yang SM ,et al. Significance of heparanase mRNA expression in gastric carcinoma tissues［J］. J Fourth Mil Med Univ,2004;25(10):909-911.
　　［4］ Dobashi Y, Shuin T, Tsuruga H, et al. DNA polymerase beta gene mutation in human prostate cancer ［J］. Cancer Res, 1994;54(11):2827-2829.
　　［5］ Matsuzuaki J, Dobashi Y, Miyamoto H, et al. DNA polymerase beta gene mutation in human bladder cancer ［J］. Mol Carcinog,1996;15(1):38-43.
　　［6］ 董子明, 赵国强,赵勤,等. 人食管癌中聚合酶β基因突变的研究［J］. 中华医学杂志,2002;82(13):899-902.
　　Dong ZM,  Zhao GQ, Zhao Q, et al. A study of DNA polymerase β mutation in human esophageal cancer［J］. Natl Med J China,2002;82(13):899-902.
　　［7］ Wang L, Patel U, Ghosh L, et al. DNA polymerase β mutation in human colorectal cancer ［J］. Cancer Res, 1992;52:4824-4827.
　　［8］ Iwanaga A, Ouchida M, Miyazaki K, et al. Functional mutation of DNA polymerase β found in human gastric cancerinability of the base excision repair in vitro ［J］. Mutation Res, 1999;435(2):121-128
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