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| 不同转移潜能骨肉瘤细胞株的建立与生物学性质的分析 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-1  |
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【关键词】 骨肉瘤 Establishment of human osteosarcoma cell sublines with different potential of metastasis and studies on their biological characteristics 【Abstract】 AIM: To get human osteosarcoma cell subclones with different potential of metastasis. METHODS: We got different monocell clones by the limited dilution method from the human osteosarcoma cell line SOSP9607. After preliminary screening by in vitro invasion assay, we selected two cell lines as high metastasis potential cell subclones and three cell subclones as low metastasis potential cell subclones. We inoculated these subclones into nude mice for three circles and obtained different metastatic potential subclones. We then inspected their different biological properties by tests of cell growth curve assay, chromosome number, soft agar cloning technique, flow cytometry and auto metastasis in nude mice. RESULTS: We got the two subclones with the different metastasis potential: low potential subclone H9 and high potential subclone E10. They had the same hypotriploid karyotype with human chromosome morphology. E10 had faster growth speed than H9 and the artificial lung metastasis rate of H9 and E10 in nude mice was 10% and 100%, respectively. The rate of S phase cell cycle was respectively 16.8% and 21.0%. CONCLUSION: These two subclones come from the same mother cell line and their difference mainly lies in the different metastatic phenotype. This study will help the screening of metastasis correlated gene, the study of the metastatic mechanism and clinical study of osteosarcoma. 【Keywords】 osteosarcoma；neoplasm metastasis；cell subclone；biological specialties 【摘要】 目的：获得不同转移潜能的骨肉瘤细胞株. 方法：从我室建立的人成骨肉瘤细胞系SOSP9607中通过有限稀释法获得不同的单细胞克隆，经过侵袭试验初筛后获得5株转移潜能不同的细胞株，再通过裸鼠体内连续传代法筛选出具有不同转移能力的细胞系.并利用细胞生长曲线测定，软琼脂克隆形成试验，流式细胞仪，裸鼠体内自发转移试验分析了他们的生物学性质. 结果：获得两株转移潜能不同的骨肉瘤细胞株.其中,H9为具有低转移潜能的骨肉瘤细胞株, E10为具有高转移潜能的骨肉瘤细胞株，其染色体众数分布特征与母系SOSP9607基本相似，保持人类染色体核型；所至皮下移植瘤及肺转移瘤均符合人成骨肉瘤组织学特征，它们具有差异明显的体外生长速度，软琼脂克隆形成率H9（22±5）明显高于E10(98±12) ，裸鼠体内试验性自发肺转移率分别为10%和100%，流式细胞仪测定H9和E10的S期细胞分别为16.8%和21.0%. 结论：这两株细胞株来源于同一亲本，他们之间的差异集中在转移表型上，为今后利用分子生物学的方法筛选出转移相关基因从而为成骨肉瘤的转移机制及临床研究奠定基础. 【关键词】 骨肉瘤；肿瘤转移；细胞株；生物学特性 0引言 肿瘤转移是一系列步骤组成的，包括侵袭周围组织，延血管或淋巴管运行、在靶器官上增殖等.自Fidler［1］提出肿瘤转移异质性概念后，国内外已相继有一些实验室建立了黑色素瘤，前列腺癌，肺癌的不同转移潜能的细胞亚系［2-4］.但从人骨肉瘤细胞中分离出具有不同转移潜能的肿瘤转移亚群的报道却不多见，这在一定程度上限制了对骨肿瘤转移机制的深入研究.为了在分子水平对其进行比较研究，获得具有相同的遗传背景不同转移潜能的肿瘤细胞株十分重要. 1材料和方法 1.1材料 成骨肉瘤细胞系SOSP9607细胞系由第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所实验室建立；RPMI 1640(Gibco, USA),胰蛋白酶（华美生物工程公司）；胎牛血清与小牛血清（兰州民海生物制品公司）；细胞培养瓶与细胞培养板（Nunc，USA）；基底膜胶（北京大学医学部细胞中心）；侵袭小室（Milipore PI8P01250，USA）；流式细胞仪（第四军医大学免疫教研室提供）；BALB/cnu/nu裸小鼠（上海思莱克动物试验有限公司）；琼脂（Spain 兰州民海生物制品公司）. 1.2方法 1.2.1SOSP9607的克隆化分离培养SOSP9607骨肉瘤细胞至对数生长期，用2.5 g/L胰酶消化，倒置显微镜下记数，梯度稀释至4.6 mL含230个细胞（每0.1 mL含5个细胞），加入96孔板前36个孔，每孔0.1 mL.还剩1.0 mL，加培养基至5 mL（每0.1 mL含1个细胞）再加入相邻的36孔，每孔0.1 mL.剩余1.4 mL，再加培养基至终体积2.8 mL，（每0.1 mL含0.5个细胞）加入剩余的24孔，每孔0.1 mL.放入培养箱中，在37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度环境下培养5 d，倒置显微镜下观察有单细胞克隆生长，补充培养基继续培养，待长满孔底后消化移至24孔板，6孔板，最后移至培养瓶中培养，得到单克隆的细胞株，分别命名为B7，B12，C2，C11，D12,E10,E12,F6,H4和H9. 1.2.2利用体外侵袭试验进行初筛将细胞培养至对数生长期后，用2.5 g/L胰酶消化，记数，加入Millipore中，每室2×105个细胞数.放入培养箱中常规培养7 h，用棉签擦去侵袭膜上的瘤细胞和基底膜胶，甲醇固定30 min，常规染色记数膜背面的细胞数，将其平均分为4个象限，每株细胞3孔，取平均值. 1.2.3原位移植法在裸小鼠体内连续传代筛选转移细胞株 1.2.3.1皮下移植瘤模型取对数生长期的细胞株，消化，记数5×106/mL，取0.2 mL（含1×106个细胞）注射于3 wk龄裸小鼠股部及颈部皮下，2 wk后开始有肿瘤生长，待长至1.0 cm×1.5 cm后处死，将其剪成直径0.5 mm大小瘤块备用. 1.2.3.2裸小鼠原位移植取3~4 wk龄裸小鼠，手术前每只裸鼠腹腔注射枸橼酸芬太尼（国产）和咪达唑仑（国产）混合液，每种药水用无菌药水稀释1倍后1∶1混合，每只裸鼠0.2 mL.手术在清洁环境下进行，将裸鼠固定后，乙醇消毒，沿右胫骨表面剪开皮肤，皮下，剥离部分胫前肌，暴露胫骨平台，用皮试针头沿45℃方向撬开一骨片，将准备好的肿瘤碎片植入骨髓腔中，盖好骨片，用尼龙线全层缝合皮下、皮肤. 1.2.3.3体内连续传代5 wk后观察到肿瘤生长，待10 wk后处死全部裸鼠，如有呼吸困难，恶液质情况立即处死，取肺组织，肉眼观察及病理切片有肺转移者，留取肺组织中较大转移结节行原代培养并进行组织学观察，培养的细胞经5次传代后按上述办法进行第二次肺转移试验，共进行3个循环，第3次（肺转移率已达100%）从裸鼠肺转移结节原代培养获得的细胞为具有高转移潜能的肿瘤细胞株，相反的，肉眼观察及肺组织切片观察3次均不转移的细胞株为具有低转移潜能的细胞.然后连续扩大培养约30代，分别冻存. 1.2.4细胞生长曲线取两株相同代数细胞株培养至对数增长期，消化计数后，调整细胞数为1×105个，接种至25 mL细胞培养瓶，每日任取3瓶细胞消化后计数，取其平均数，连续7 d后绘制细胞生长曲线. 1.2.5H9,E10与母系SOSP9607细胞染色体的制备染色体制备参照鄂征［5］所介绍的方法. 1.2.6软琼脂克隆形成试验用三蒸水制备浓度为12 g/L的低熔点琼脂糖液，高压灭菌后，放于40℃水浴锅中防止凝固.按1∶1混合12 g/L琼脂糖液和2×DMEM（含200 mL/L小牛血清），取3 mL上述液体注入直径3.5 cm的平皿中，冷却凝固.消化细胞制成悬液并计数.按1∶1混合0.7 mg/L琼脂糖液和2×DMEM（含200 mL/L血清），在上述3 mL液体中加入0.2 mL细胞悬液（含600个细胞）充分混匀，注入底层琼脂已凝固的平皿，冷却凝固.置37℃孵箱中培养10~14 d，计录克隆形成数. 1.2.7裸鼠实验性肺转移率测定按常规分别消化培养瓶中的两株同代克隆细胞株，制成细胞悬液，经细胞计数后按每鼠1×105细胞量在无菌环境下分别注入两组裸鼠（每组10只）的尾静脉.实验鼠均在接种瘤细胞后1.5 mo后处死，分别取出两组裸鼠的肺作全面的病理学检查，计算其转移率. 1.2.8流式细胞术测定细胞周期分布收集培养瓶中细胞，PBS洗涤，用体积分数750 mL/L的冷乙醇固定.将细胞数调整在1×105/mL左右，溴化丙锭染色，上机检测. 统计学处理：数据用x±s表示，采用SPSS 10.0软件进行数据处理，不同细胞株间比较采用方差分析及SNKq检验；H9与E10之间软琼脂克隆细胞数比较采用t′检验，P<0.05为有统计学意义. 2结果 2.1体外侵袭试验10个细胞株在侵袭试验中穿过侵袭膜的细胞数(x±s)分别为B7: (78±12.4), H9: (93±15.1), C2: (221±30.5), C11: (218±25.5), D12: (296±20.2), E10: (406±34.5), E12: (428±36.5), H4: (274±16.3), B12: (398±32.2), F6: (223±12.2)经方差分析及SNKq检验各细胞株可分为三组：B7和H9为低侵袭组，E10，E12，B12为高侵袭组，其余的为中侵袭组(n=12, P<0.01). 2.2体内连续传代观察 2.2.1皮下移植瘤2 wk左右皮下均形成移植瘤，经组织组织学观察及肉眼观察证明它们仍是成骨肉瘤细胞而且未见肺转移（Fig 1）. 2.2.2原位移植瘤原位移植后经5 wk左右，原位始见有肿瘤生长，10 wk左右处死时，裸鼠活动能力下降.H9连续3代原位移植均不发生肺转移，E10经3次肺转移试验后，肺转移率为100%(Fig 2,3). 2.3细胞生长曲线测定两株细胞生长曲线如Fig 4，可见E10体外生长速度明显快于H9. 2.4染色体众数检查2个克隆细胞株与母系细胞的染色体众数分布特征基本相似，其中染色体在46~60之间的细胞都近0.8（内复制不计在内）. 2.5软琼脂克隆形成试验两株细胞株的克隆细胞数分别为H9（22±5），E10(98±12)，两者间差异有统计学意义（P<0.05）. 2.6裸鼠实验性肺转移率测定分别经尾静脉给两组裸鼠注射H9和E10细胞株，其自发的转移率分别为10%和100%，且E10的形成结节大而密. 2.7流式细胞术测定细胞周期经流式细胞仪进行细胞周期分析发现，E10的S期细胞比例较多(Tab 1).表1H9,E10和母系SOSP9607的细胞周期分布（略） 3讨论 根据肿瘤异质性理论［1］，在一个原发性恶性肿瘤细胞群中，并不是所有瘤细胞均具有侵袭和转移能力，仅某些特殊亚群才具有转移潜能，产生转移表型.建立具有稳定转移表型的肿瘤亚系，是研究肿瘤转移，如转移的过程，转移机制，转移性瘤细胞和宿主的相互作用，转移和瘤细胞的粘连分子，癌基因和其产物的关系，肿瘤转移的干预治疗试验等一系列试验研究所需要的最基本材料. 与转移性细胞亚系的建立途径不同，转移性瘤细胞单克隆细胞株的建立是从异质性母细胞系群体中分离出来单个瘤细胞，经扩增形成细胞株.由于这些克隆细胞株起源于单个细胞，其异质性有可能减至最低限度，这非常有利于许多比较性试验，试验结果的重复性和可靠性也最好.近年的许多试验都是以来源于同一母系的不同转移能力的单克隆细胞株完成的，如转移相关基因nm23就是从不同转移能力的B16黑色素细胞瘤单克隆细胞株中发现的［2］. 从各项体内外实验可以看出，E10体外生长速度明显较快，细胞周期测定S期细胞较多，裸鼠自发性肺转移率接近100%，克隆形成率高.表明E10为转移潜能较高的细胞株.H9为转移潜能较低的细胞株.为下一步利用mRNA差异基因显示技术［6］ 甚至直接利用蛋白质组技术［7］发现骨肉瘤转移相关的基因及肿瘤标志物提供了理想的试验模型 |
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