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| 人外周血树突状细胞的诱导、培养及其表面标记的鉴定 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-1  |
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【关键词】 树突状细胞；外周血；共刺激分子 0引言 树突状细胞(dendritic cells, DC)的特点及功能是目前肿瘤免疫研究的热点，本研究将在DC的培养及其表面标记等方面做进一步的探讨, 为DC的进一步研究奠定基础. 1材料和方法 1．1材料 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGMCSF)，重组人白细胞介素4 (IL4) ，肿瘤坏死因子α(TNFα) 均购自深圳晶美公司, FITC标记的单抗：CD83，CD40，HLADR，CD86购自深圳晶美公司. 淋巴细胞分离液(上海试剂二厂) ,小牛血清(杭州四季青生物工程公司). 仪器： 美国B2D公司FACS Calibur流式细胞仪,Nikon荧光显微镜. 1．2方法 室温下将25 mL的富含白细胞的血液成分与等量淋巴细胞分离液混合，使用FicollHypaqu密度梯度离心法，室温3000 r/min，离心20 min后收集单个核细胞. 调节细胞浓度为106/mL,然后在6孔板上贴壁,每孔加2 mL, 3 h后吸去悬浮细胞,并用37℃预温新鲜培养液轻轻洗去未贴壁的细胞，加入Ⅰ号营养液:100 mL/L小牛血清RPMI 1640中含GMCSF 50 ng/ mL, IL4 10 ng/mL,在37℃， 50 mL/L CO2孵箱中培养,每日半量换液1次,第3次换液用Ⅱ号营养液： 100 mL/L小牛血清RPMI 1640 中含GMCSF 50 ng/ mL, IL4 10 ng/mL, TNFα 20 ng/mL,仍每日半量换液1次. 细胞培养至10 d左右收集，FITC标记的CD83, CD40, HLADR, CD86,标记DC并用流式细胞仪检测，并拍摄细胞照片. 2结果 树突状细胞的光镜下形态： 树突状细胞比淋巴细胞大,直径在10～20μm之间,有许多刺状突起,分布于细胞表面(图1). 培养10 d后,流式细胞仪分析, 其中CD83 0.92, CD40 0.30, HLADR 0.90, CD86 0.90. 3讨论 树突状细胞是目前发现的功能最强的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC)，能摄取加工和提呈抗原. DC表达高水平MHCⅠ, MHC Ⅱ类分子，共刺激分子和粘附分子,能够显著刺激初始型T 细胞(Naive T cells) 增殖,A: ×400; B: ×200. 启动T 细胞介导的免疫反应. DC在免疫学、肿瘤学及其他各学科的作用日益受到重视［1］. 目前作为治疗用的DC主要来源于骨髓与外周血,通过骨髓(主要为CD34+) 或外周血中(主要为CD14+) 的造血干细胞. 但外周血中的造血干细胞比骨髓中更少,其培养难度也高,必须用最佳的细胞因子进行诱导. 培养DC 的细胞因子组合有多种方案,其中主要有GMCSF, IL4，TNFα等［2,3］,在DC培养基中仅加入GMCSF和IL4,只能培养出不成熟的DC,只有加入另外的一种或多种细胞因子如TNFα, IFNγ等方可诱导产生成熟的DC［4,5 ］. 本文选用GMCSF, IL4, TNFα这一细胞因子组合,因为GMCSF可促进DC增殖，IL4则可抑制巨噬细胞增生而利于干细胞向DC分化,TNFα可促进DC成熟. 本研究发现如果每天进行半量换液则细胞状态较隔天半量换液为好，有利于对DC进行进一步的处理. 目前鉴定DC仍然要靠细胞形态和细胞表面共刺激分子等来综合鉴定DC. 对DC表面分子有必要作进一步的研究以寻求DC特异性标记,为DC用于临床免疫治疗奠定基础. 【参考文献】 ［1］ Sting G, Bergtresser PR. Dendritic cells： A major story unfold ［J］. Immunol Today, 1995;16:330-335. ［2］ Alters SE, Gadea JR, Holm B, et al. IL13 can substitute for IL4 in the generation of dendritic cells for the induction of cytotoxic T lymphocytes and gene therapy ［J］. J Immunother, 1999;22(3):229-236. ［3］ Ferlazzo G, Klein J, Paliard X, et al. Dendritic cells generated from CD34+ progenitor cells with flt3 ligand, ckit ligand, GMCSF, IL4, and TNFalpha are functional antigen presenting cells resembling mature monocytederived dendritic cells ［J］. J Immunother, 2000;23(1):48-58. ［4］ Sallusto F, Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocytemacrophage colonystimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor α ［J］. J Exp Med, 1994;179(6):1109-1116. ［5］ Luft T, Pang KC, Thomas E, et al. TypeⅠIFNs enhance the terminal differentiation of dendritic cells ［J］. J Immunol, 1998;161(4):1947-1953. |
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