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趋化因子受体CCR7在乳腺癌淋巴结转移中的作用           ★★★ 【字体：小 大】
趋化因子受体CCR7在乳腺癌淋巴结转移中的作用
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-1    
作者：朱旬，甄林林，郑伟，王汉晋，王萱仪，武正炎
【关键词】  乳腺肿瘤；,转移；,淋巴结；,CCR7
　　Effect of chemokine receptor CCR7 in breast cancer tissue on lymph node metastasis
　　【Abstract】 AIM: To detect the expressions of chemokine receptor CCR7 protein and its mRNA in breast carcinoma, and to discuss their relationship with lymph node metastasis. METHODS: The expressions of chemokine receptor CCR7 mRNA and protein in 42 cases of breast carcinoma and 10 cases of breast fibroadenoma tissue were detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) and SP immunohistochemical technique. RESULTS: There were 18 cases of positive expression of CCR7 mRNA and 15 of CCR7 protein in 42 cases of breast carcinoma tissue. The positive expression rate of CCR7 protein  (11.1%) in patients without lyphm node metastasis was significantly lower than that (54.2%) in patients with lyphm node metastasis (P＜0.01). The positive rate in clinical stage Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ were 0%, 39.1%, 60.0%, respectively (P<0.01). The positive expression of CCR7 was correlated with lymph node metastasis as well as clinical stage. CONCLUSION: CCR7 may contribute to lyphm node metastasis in breast cancer.
　　【Keywords】 breast carcinoma; metastasis; lymph node; CCR7
　　【摘要】 目的：探讨趋化因子受体CCR7在乳腺癌中的表达意义. 方法：应用RTPCR及免疫组织化学方法检测42例乳腺癌组织和10例乳腺纤维腺瘤中CCR7的表达. 结果：在乳腺癌组织中CCR7 mRNA表达42.9%， CCR7蛋白表达35.7%，在乳腺纤维腺瘤中仅有1例CCR7 mRNA表达. 无淋巴结转移者CCR7蛋白阳性表达率为11.1%（2/18），而有淋巴结转移阳性表达率为54.2%（13/24）（P＜0.01）；临床TNM分期Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ期的阳性表达率分别为0%，39.1%，60.0%（P＜0.01）. 结论：CCR7可能是介导淋巴结转移和组织浸润的重要机制之一.
　　【关键词】 乳腺肿瘤； 转移； 淋巴结； CCR7
　　0引言
　　目前肿瘤细胞向淋巴结侵袭转移的机制仍然未完全阐明. 趋化因子受体CCR7（CC chemokine receptor 7）在多种免疫细胞上表达，它及其配体在引导这些细胞向淋巴组织或器官归巢中起主导作用. 最近的研究发现，它也在恶性肿瘤细胞上表达，并且在肿瘤细胞淋巴道转移过程中起重要作用. 我们检测乳腺癌细胞株和乳腺癌组织中CCR7的表达水平，以及与淋巴结转移的关系.
　　1材料和方法
　　1.1材料人乳腺癌MDAMB231和MDAMB435s细胞培养用含100 mL/L胎牛血清的L15培养液（Gibco公司），人乳腺癌MCF7细胞培养用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液（Gibco公司），培养条件为37℃，50 mL/L CO2饱和湿度. 200403/200412在江苏省人民医院行乳腺癌手术42例，乳腺纤维腺瘤10例，均为女性，乳腺癌患者年龄29～72（中位43）岁，手术后常规病理诊断确诊为乳腺癌，并进行免疫组织化学检测ER，PR.
　　1.2方法
　　1.2.1RTPCR组织100 mg在液氮中研碎后，用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA，并用紫外分光光度计测定RNA浓度. 采用逆转录试剂盒（Promega公司，A3500）合成cDNA，配制20μL 反应体系：RNAsin 20 U，Oligo (dT) 15 0.5 μg，RNA模板1.5 μg，逆转录缓冲液1 mmol/L，AMV反转录酶15 U，dNTPs 1 mmol/L，MgCl2 25 mmol/L，混匀后42℃反应1 h，95℃ 5 min，4℃放置10 min. PCR反应体系50 μL：模板cDNA（约50 ng），上、下游引物（各50 pmol/L），94℃ 4～5 min，立即冰浴，瞬时离心，加入PCR缓冲液（4.8 μL），MgCl2（3.8 μL），dNTPs（0.9 μL），Taq酶（Promega公司，M1661） 2.5 U，最后加无核酸酶的水定容为50 μL. RTPCR引物：上游5′AAGGGTCAGGAGGAAGAGGA3′,下游5′GGCTGGTCGTGTTGACCTAT3′ (102 bp). 反应条件为: 95℃预变性5 min，94℃ 60 s, 56℃ 60 s，72℃ 60 s，30个循环. 同时应用βactin作为内对照，引物：5′CGGTTGGCCTTGGGGTTCAGGGGG3′，下游5′ATCGTGGGGGCGCCCCAGGCACCA3′（242 bp），引物由上海华诺生物科技有限公司合成. PCR产物5 μL经20 g/L琼脂糖凝胶电泳观察.
1.2.2免疫组织化学采用SP法，鼠抗人CCR7一抗（R & D公司），其他试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司. 用已知阳性结果标本切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照. ER，PR以细胞核有黄色颗粒为阳性细胞，CCR7以细胞膜或细胞质呈现棕黄色为阳性细胞（图1）. 高倍镜下连续计数5个视野，染色细胞数＞25%定为阳性，≤25%为阴性.
　　A： ER阳性； B： CCR7阳性.
　　图1乳腺癌免疫组织化学结果×200（略）
　　统计学处理：采用统计学软件SPSS 11.5进行χ2检验.
　　2结果
　　经RTPCR扩增后，产物为102 bp的片段，在乳腺癌组织中有18例(42.9%)检测出CCR7 mRNA的表达(图2) ，在3种乳腺癌细胞株中，MDAMB435s表达阳性，而乳腺纤维腺瘤中仅有1例(10.0%)表达阳性. 乳腺纤维腺瘤10例无CCR7蛋白表达，在乳腺癌组织中35.7%（15/42）表达阳性. CCR7阳性表达与肿瘤大小、ER和PR阳性表达无关（P＞0.05）. 无淋巴结转移者CCR7阳性表达率为11.1%（2/18），而有淋巴结转移阳性表达率为54.2%（13/24），其中淋巴结转移数3个以内者阳性率46.2%（6/13），4个以上者阳性率63.6%（7/11），有统计学意义（P=0.007）；临床TNM分期Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ期的阳性表达率分别为0%，39.1%，60.0%（P=0.005，表1）. 在乳腺癌细胞株MDAMB435s的CCR7 mRNA表达与蛋白表达均为阳性，乳腺癌组织中CCR7 mRNA表达与蛋白表达也有很高的一致性，18例CCR7 mRNA表达阳性病例中14例蛋白表达阳性，24例CCR7 mRNA表达阴性病例中23例蛋白表达阴性.
　　M：Marker；1：MDAMB435s乳腺癌细胞株；2，3：乳腺癌组织；4：乳腺纤维腺瘤；5：MDAMB231乳腺癌细胞株；6：MCF7乳腺癌细胞株.
　　图2CCR7 RTPCR扩增电泳图（略）
　　表1乳腺癌组织CCR7蛋白表达与临床病理的关系（略）
　　bP＜0.01 vs相应项目.
　　3讨论
　　肿瘤细胞由原发灶向区域淋巴结转移与一些蛋白水解酶和生长因子有关，如金属基质蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）,血管生长因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGFC）等［1-3］，然而内在趋化吸引因子可能在此过程中起着至关重要的步骤. Mashino等［4］用半定量RTPCR的方法检测了64例胃癌组织标本，其中68.8% CCR7 mRNA表达，免疫组织化学结果60%为阳性，并且CCR7表达阳性与淋巴结转移、淋巴管浸润、组织学分级差、分期晚和预后差相关，由此提示CCR7及其配体的相互作用与胃癌淋巴结转移有关. 有学者通过胃镜活检组织检测CCR7和VEGFC预测淋巴结转移情况并指导手术范围的可能性［5］. 在非小细胞肺癌中，CCR7 mRNA表达也是判断淋巴结转移独立的预后指标［6］. 乳腺癌细胞株CCR7有不同程度表达，且与趋化活性和侵袭力相关［7］. 在本组乳腺癌组织中CCR7蛋白阳性表达与淋巴结转移和临床分期有关，而与肿瘤大小、ER和PR阳性表达不相关. 由于淋巴结转移状况是影响乳腺癌预后的重要因素，因而CCR7表达可能也是影响因素之一. Tamamura等［8］发现在体外CXCR4拮抗剂T140，可以抑制乳腺癌细胞MDAMB231的移行，在人乳腺癌裸鼠动物模型中，可以降低肺转移的发生. 因此，淋巴细胞归巢途径与恶性肿瘤细胞淋巴结转移途径相似，CCR7及其配体的相互作用可能是介导淋巴结转移和组织浸润的重要机制之一，针对性的拮抗剂有望成为恶性肿瘤治疗新的靶点.
　　【参考文献】
　　［1］ 王新友,王岭,王辉,等. 乳腺癌患者血浆基质金属蛋白酶2, 9的明胶酶谱分析［J］. 第四军医大学学报,2005,26(11):1015-1017.
　　［2］ 李伟,张建国. 乳腺癌中肿瘤相关淋巴管生成［J］.中国现代普通外科进展，2005,8(2):67-68.
　　［3］ Randolph GJ, Angeli V, Swartz MA. Dendriticcell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels ［J］. Nat Rev Immunol, 2005,5(8):617-628.
　　［4］ Mashino K, Sadanaga N, Yamaguchi H, et al. Expression of chemokine receptor CCR7 is associated with lymph node metastasis of gastric carcinoma ［J］. Cancer Res, 2002,62(10):2937-2941.
　　［5］ Yan C, Zhu ZG, Yu YY, et al. Expression of vascular endothelial growth factor C and chemokine receptor CCR7 in gastric carcinoma and their values in predicting lymph node metastasis ［J］. World J Gastroenterol,  2004, 10(6):783-790.
　　［6］ Takanami I. Overexpression of CCR7 mRNA in nonsmall cell lung cancer: Correlation with lymph node metastasis ［J］. Int J Cancer, 2003, 105(2):186-189.
　　［7］ 马飞,宁力,张颖妹,等. 趋化因子受体CCR7促进乳腺癌细胞的趋化与侵袭［J］. 第四军医大学学报,2004,25(20):1883-1886.
　　［8］ Tamamura H, Hori A, Kanzaki N, et al. T140 analogs as CXCR4 antagonists identified as antimetastatic agents in the treatment of breast cancer ［J］. FEBS Lett, 2003, 550(13):79-83
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