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| 传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-1  |
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【关键词】 内皮,血管/细胞学；抑制消减杂交；动脉硬化 【Abstract】 AIM: To construct a subtracted cDNA library of differentially expressed genes in freshly isolated adult bovine aortic endothelial cells (FiBEC) and cultured newborn aortic endothelial cells(CnBEC). METHODS: The suppression subtractive hybridization (SSH) was used to isolate cDNA fragments of nonexpressed or lowexpressed genes in CnBEC . Then these cDNA fragments were directly inserted into T/A cloning vestor to set up the subtractive library. The amplified library was randomly picked and identified using restriction enzyme digestion. RESULTS: The amplified library contained more than 760 bacterial clones. The 64 clones picked randomly showed that all clones contained 200-600 bp inserts after restriction enzyme digestion. CONCLUSION: The library lays a foundation for screening and cloning the arteriosclerosisrelated genes in early stage. 【Keywords】 endothelium; vascular/cytology; suppression subtractive hybridization; arteriosclerosis 【摘要】 目的： 构建传代培养前后牛主动脉内皮细胞差异表达基因的消减cDNA文库，筛选动脉粥样硬化相关新基因构建文库. 方法： 采用抑制消减杂交技术，以新鲜分离和传代培养的牛主动脉内皮细胞作为对比材料，分离传代培养主动脉内皮细胞中不表达或低表达基因的cDNA片段，将其与T载体进行T/A连接构建文库，将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后，随机挑取64个白色克隆进行酶切鉴定. 结果： 扩增消减cDNA文库获得760个克隆，随机挑取的64个阳性克隆经酶切后均有200~600 bp的插入片段. 结论： 构建的传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库，为进一步筛选早期发生改变的动脉粥样硬化相关基因奠定了工作基础. 【关键词】 内皮，血管/细胞学；抑制消减杂交；动脉硬化 0引言 动脉粥样硬化是一种多因素损伤性疾病，许多基因在病变过程中均发生了改变，对发生变化的基因的深入认识将为探寻动脉粥样硬化的发病机理及病变特征提供坚实的理论基础. 国内外报道的动脉粥样硬化相关基因多是oxLDL损伤前后培养的脐静脉内皮细胞差异表达的基因，所报道的许多基因的变化是与动脉粥样硬化病变中发生改变的因子相吻和的［1］. 但尚不具备病变组织特异性和病理损伤特异性. 在血管内皮细胞培养后和动脉粥样硬化病变早期都发生G蛋白偶联受体功能的明显减弱或丧失［2-3］，从这一点上讲血管内皮细胞离体培养过程模拟了动脉粥样硬化病变早期血管内皮细胞发生的病理改变. 本研究采用SSHR技术，构建新鲜分离的成牛主动脉内皮细胞和传代培养的新生牛主动脉内皮细胞差异表达基因的消减cDNA文库，为进一步筛选早期发生改变的动脉粥样硬化相关基因奠定工作基础. 1材料和方法 1.1材料成牛主动脉(购自北京市大红门清真食品厂)培养分离后获得新鲜内皮细胞；传代(10代)培养的新生牛主动脉内皮细胞(美国CnBEC公司)；大肠杆菌菌株TG1本室保存；载体pGEMT,磁珠分离mRNA提取试剂盒（美国Promega公司）；总RNA提取Trizol 试剂,DMEM培养基干粉,胎牛血清,SuperScriptTMRNaseH活性缺失反转录酶（美国Gibco BRL公司）；抑制削减杂交试剂盒（美国Clontech公司）；质粒提取试剂盒,PCR产物胶回收试剂盒（上海华舜公司）；IPTG, Xgal, TaqDNA聚合酶（上海生工公司）；保真LA Taq酶,DL2000核酸分子质量标准（大连TaKaRa公司）. 1.2方法 1.2.1牛主动脉内皮细胞总RNA及mRNA分离提取参照Trizol 试剂说明进行RNA提取；参照Z5300磁珠分离mRNA试剂盒操作说明进行mRNA分离提取. 1.2.2抑制消减杂交参照文献［4］及SSH试剂盒说明以FiBEC cDNA为检测子（Tester），以CnBEC cDNA为驱赶子（Driver）. ① 双连cDNA的合成：取Tester 和Driver mRNA 各2 μg（4 μL）分别与1 μL cDNA合成引物混合，在3.3×108 nkat/L AMV反转录酶1 μL作用下合成第一链cDNA. 立即在第一链合成反应液中加入20×第二链酶混合物、dNTP等，16℃反应30 min，合成双链cDNA. 抽提并沉淀cDNA，将沉淀物溶于50 μL灭菌水中. ② 双链cDNA的酶切：取Tester 和Driver双链cDNA各43.5 μL，分别用RsaⅠ 1.5 μL于37℃酶切1.5 h. 将未经酶切的ds cDNA 2.5 μL 与经酶切的ds cDNA 5 μL 用10 g/L琼脂糖明胶电泳进行酶切效率的分析. 酶切完全后，将酶切产物进行沉淀，沉淀物溶于5.5 μL灭菌水中. ③ Tester双链cDNA与接头的连接：将酶切后的Tester cDNA 按1∶6稀释，各取2 μL在T4DNA连接酶作用下，分别与接头1和接头2于16℃连结过夜. 取1 μL连接产物用200 μL灭菌水稀释，进行连接效率分析. 接头序列的adapter1 (5′CTAATACGA CTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT3′；3′GGCCCGTCCA5′) 及adapter 2 (5′CTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT3′；3′ GCCGGCTCCA 5′). ④ 两轮消减杂交： 检测接头连接效率满意（25%）后，将连接有不同接头的Tester ds cDNA，于68℃杂交过夜. 加入200 μL稀释缓冲液. ⑤ 两轮抑制PCR： 取1 μL消减杂交产物用两个接头的外侧序列引物（5′ CTAATACGACTCACTATAGGGC 3′）进行首轮PCR扩增. 将PCR产物按1∶10 稀释，取1 μL用两个接头的内侧序列引物（5′ TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT 3′）及（5′ AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT 3′）进行第二次PCR扩增. 产物用20 g/L琼脂糖凝胶进行电泳分析. 1.2.3消减cDNA文库的构建参照文献［5］，用PCR产物纯化试剂盒纯化第二次PCR产物，按1∶1的浓度比混合纯化后的PCR产物及pGEMT 载体，在T4DNA连接酶作用下，16℃连结过夜. -20℃冻存. 1.2.4消减cDNA文库的扩增及鉴定用常规CaCl2法制备大肠杆菌TG1感受态细胞，取5 μL连接产物进行常规转化，然后蓝/白筛选重组子，挑取单个的白色菌落接种96孔板(每孔含100 μL Amp+ LB)，140 r/min，37℃摇菌3 h，每孔加入80%甘油25 μL，适当混匀，-70℃保存菌种. 共挑取接种8个96孔板约760个白色菌落进行繁殖. 碱裂解法小量提取细菌质粒，PstⅠ 进行酶切，产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定. 2结果 2.1总RNA的提取、定量与完整性鉴定Trizol试剂提取FiBEC和CnBEC的总RNA的紫外检测与定量结果见表1. 从数值中可见提取的两种总RNA的A260 nm/A280 nm均大于1.7，说明提取的RNA中蛋白质和DNA残留极少. 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析结果表明，28 S，18 S和5 SrRNA条带清楚，且28 S∶18 S约为2∶1，说明提取的RNA质量较好，没有发生降解（图1）.表1总RNA的紫外定量分析 2.2mRNA的提取与定量对从提取的全部总RNA中分离的polyA+ RNA进行紫外检测定量结果表明，提取的两种mRNA的A260 nm/A280 nm均在2.0左右，说明提取的mRNA符合要求（表2）. 通过加入适量的无RNase水将两种mRNA浓度调整为0.5 g/L. 2.3双链cDNA的大小和RsaⅠ酶切效率的分析 酶切前后双链cDNA的12 g/L琼脂糖凝胶电泳图谱见图2. 酶切前两种双链cDNA呈现为大小介于500~5000 bp之间的弥散条带，这说明制备的双链cDNA质量较好，长度符合完整哺乳动物cDNA长度特征，没有过小和过大的条带. 经RsaⅠ酶切后，cDNA片段大小明显降低，介于200~2000 bp之间，集中分布于500 bp左右，与预期完全一致(RsaⅠ识别四核苷酸对AC↓GT，平均每256 bp出现一个酶切位点，经统计学计算cDNA经酶切后平均大小为500 bp)，说明酶切完全.表2mRNA的紫外定量分析 2.4消减文库构建中两轮抑制PCR产物分析正向文库构建中两轮抑制PCR产物分析第1轮PCR后，试剂盒提供的阳性对照扩增出明显的条带，片段大小与试剂盒所描述的一致，而未削减的对照经扩增可见到较亮的拖尾，削减后的样品中则扩增出夹杂有明显扩增条带的拖尾；利用巢式引物进行第2轮PCR后，试剂盒提供的阳性对照扩增出的条带进一步增亮，片段大小与试剂盒所描述的一致，而未削减的对照呈很亮的拖尾，但见不到明显的条带，削减后的样品中扩增出的条带亮度进一步增加，这说明有一些片段确实得到了有效的富集（图3）. 2.5抑制消减效率的鉴定选择被证明在Tester样本和Driver样本中表达基本无差异的基因牛m4受体的innerloop3区作为扩增对象，通过不同轮次的扩增，观察其在等量削减片段库和未削减对照片段库中的相对丰度. 未削减对照片段库(10 ng)在32个循环扩增就可看到明显的特异扩增带，并且随着扩增轮次的增加，产物量逐步提高；而同样取样10 ng的正向削减片段库通过36轮循环扩增仍然未见扩增条带，将36轮循环扩增产物取1 μL作为扩增底物，通过附加10个循环的2轮PCR，才能见到特异扩增带，说明经过两轮杂交和两轮抑制PCR，牛m4受体片段的相对丰度大大降低（图4）. M: DL2000 marker；1: 正向削减文库的第1轮PCR；2: 正向削减文库的第2轮PCR；3: 未削减对照样品的第2轮PCR；4: 未削减对照样品的第2轮PCR；5: 试剂盒提供的阳性对照的第1轮PCR；6: 试剂盒提供的阳性对照的第2轮PCR. 2.6正向文库的克隆与插入片段的扩增分析通过蓝/白斑筛选阳性菌落，然后挑取了760个克隆，并通过PCR手段将插入片段分别扩增出来，随机挑取了64个孔(克隆)PCR产物上样电泳，含有单一扩增条带的有59个孔，阳性率为92%，片段大小集中分布于200~600 bp之间. 根据单一扩增条带的阳性率，估计可供筛选的差异片段约为580个. 3讨论 抑制削减杂交(SSH)技术［6］是一种以抑制PCR反应为基础的cDNA削减杂交方法. 经过一轮杂交便可使稀有cDNA富集1000~5000倍［4］. 除此以外，SSH方法还具有快速、简便、所需mRNA量较少(1~2 μg)的特点，并且由于SSH削减文库构建过程中每一步都有质控方法，可以简便地检测每一步的效率，使最终的差异片段中假阳性率较低且重复性较好. 本研究的目的在于筛选动脉粥样硬化早期发生改变的基因，在构建削减文库的过程中需要对每个步骤进行有效的检测，以确保最终获得的文库的质量. 在cDNA合成阶段选用了SuperScriptTMRNaseH活性缺失反转录酶以替换试剂盒中提供的RNaseH活性较强的AMV反转录酶，以便在反转录中尽可能的获得全长序列. 从电泳结果看，合成的双链cDNA长度符合要求，没有过小的片段，随后进行的酶切效果也十分理想. 在削减效率的初步评价中，根据实际情况选用在两个样本中表达无明显差异的m4受体的innerloop3 DNA片段作为扩增对象，结果显示这一基因片段的丰度得到了极大的降低，提示两轮杂交实现了有效的削减. 本研究利用以抑制性PCR为基础的抑制削减杂交技术，成功地构建了正、反向的新鲜分离的成牛主动脉内皮细胞与传代培养的新生牛主动脉内皮细胞削减cDNA文库，从而为进一步筛选鉴定动脉粥样硬化相关基因提供了实验素材. 【参考文献】 ［1］ Monajemi H, Arkenbout EK, Pannekoek H, et al. Gene expression in atherogenesis［J］. Thromb Haemost, 2001,86 (1):404-412. ［2］ Markov KhM. Molecular mechanisms of dysfunction of vascular endothelium［J］. Kardiologie, 2005,45(12):62-72. ［3］ Shimokawa H, Nakaike R, Takeshita A, et al. Significance of defective endothelial signal transduction in impaired endotheliumdependent relaxation in atherosclerosis［J］. Gerontology, 1995,41:28-33. ［4］ Diatchenko L, Lau YF, Campbell AP, et al. Suppression subtractive hybridization: A method for generating differentially regulated or tissuespecific cDNA probes and libraries［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93:6025-6030. ［5］ Zhang H, Zhou L, Yang R, et al. Identification of differentially expressed genes in human heart with ventricular septal defect using suppression subtractive hybridization ［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2006,342(1):135-144. ［6］ Wang X, Feuerstein GZ. Suppression subtractive hybridisation: Application in the discovery of novel pharmacological targets ［J］. Pharmacogenomics, 2000,1:101-108 |
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