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| 改良人源LL | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-4  |
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【关键词】 人源杀菌肽LL Fusion expression and bactericidal activities of the reconstructed human cathelicidin LL37 【Abstract】 AIM: To express and purify the reconstructed LL37 (rLL37) and study its bactericidal activity. METHODS: The DNA sequence of rLL37 was recombined with vector pET30a（+）, and expressed in E.coli BL21 star (DE3) by the induction of IPTG, thus the 6×His tagged fusion protein rLL37 was obtained. After the expressed product was purified by affinity binding chromatography with TALON resins, the product was certified by SDS PAGE, Western blot and cleaved by thrombin fector Xa. Then, by using high positive ion exchange column MacroPrep High S, we purified the cleaved product and collected the every elution peak. Finally, the bactericidal activity of the rLL37 was determined by the means of inhibitory zone. RESULTS: The DNA sequence of rLL37 was inserted into vector pET30a (+) and expressed in E.coli BL21 star(DE3). Gel scanning analysis showed that fusion protein accounted for 35% of total bacterioprotein. After the fusion protein was purified and certified by SDSPAGE, a single Mr 4000 strip may be found. Then, the rLL37 was proved by the means of inhibitory zone to be able to kill both Gramnegative bacteria and Grampositive bacteria. CONCLUSION: It is possible that the rLL37 is expressed in procaryotic cell by fusion and it possesses a strong bactericidal activity. 【Keywords】 human cathelicidin LL37; fusion expression of protein; bactericidal activity 【摘要】 目的： 将改良LL37多肽以融合肽形式表达、纯化，并初步研究其杀菌活性. 方法： 将编码改良的LL37多肽的DNA序列放入载体pET30a（+），转入工程菌BL21 star(DE3)中，用IPTG诱导表达得到含6×His标记的改良融合蛋白LL37. 再以TALON柱芯亲和层析、SDSPAGE和Western blot鉴定后，用FXa裂解融合肽. 将裂解后多肽进一步用强阳离子交换柱MacroPrep High S纯化、收集各洗脱峰, 脱盐、冻干. 采用抑菌圈法检测改良LL37的抗菌活性. 结果： 改良的LL37多肽于载体pET30a（+）在杆菌BL21 star(DE3)中高效融合表达，用凝胶扫描显示融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的35％. 融合蛋白经纯化后用SDSPAGE鉴定在Mr 4000处见单一条带. 经抑菌圈法检测改良的LL37多肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很好的杀菌力. 结论： 改良的人源性LL37多肽以原核细胞进行融合表达是可行的，并具有较强的杀菌活性. 【关键词】 人源杀菌肽LL37；蛋白质融合表达；杀菌活性 【中图号】 Ｑ７８ 0引言 人类惟一的cathelicidin gene所编码的蛋白质为hCAP18 (human Cationic antimicrobial protein 18), LL37是Cthelincidin蛋白hCAP18 C端的37个氨基酸片段,为Mr 4.5×103的阳离子两性分子α螺旋抗菌肽，其氨基酸残基序列为LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES［1-2］. LL37抗菌力较昆虫细胞源性抗菌肽的杀菌力弱. 最新分离出恒河猴的同源蛋白RL37与LL37同源性很高,其净正电荷为+8,而LL37为+5.8，RL37的抗菌活性要高于LL37［3-4］. 根据SAR （structureactivity relationship）研究显示所有α螺旋抗菌肽的抗菌活性和抗菌普与肽链中所带正电荷、疏水性氨基酸数目密切相关，通过分子改造增加LL37肽链中正电荷的氨基酸和碱性氨基酸数目，而不改变其α螺旋构象来提高其抗菌活性是一种较好的途径［5-6］. 本实验室对LL37进行改良，将Glu16,Asp26,Glu36分别替换为Gln16，Asn26，Gln36，净电荷由+5.8提高至+9. 经PCR获得编码改良LL37的DNA全长基因片段，并且所设计的DNA序列中其引导序列含有凝血因子Xa酶切位点和带负电荷的承载蛋白. 我们通过构建适宜的表达载体、采用融合肽形式以大肠杆菌表达rLL37，将其克隆到含有6×His的特异亲和纯化标志序列的表达载体PET30a（+）中，从而在E.coli中表达出能被正确切割产生有抗菌活性的融合蛋白［7-8］. 1材料和方法 1.1材料BL21 star菌、pET30a(+)，pMD18T和鼠抗6×His mAb购自ROCHE公司；DH5α菌由本研究所保存；Ex Taq，SacⅠ，HindⅢ，Fxa裂解试剂盒购自TaKaRa公司；6×His亲和纯化TALON柱芯及强离子交换柱芯MacroPrep High S分别购自Clontech公司和BioRad公司；改良杀菌肽LL37的DNA序列为本所构建. 1.2方法 1.2.1rLL37多肽融合表达质粒的构建将本所已构建的改良杀菌肽LL37的DNA序列经17 g/L凝胶电泳、纯化，以连接试剂盒（TAKARA）连接入pMD18T载体并转入感受态DH5a菌中，铺LB板（含Xgal 0.04 g/L，IPTG 0.024 g/L，Amp 0.1 g/L）进行蓝白斑筛选，测序正确的单菌落进行扩增、抽质粒，并进行双酶切（SacⅠ及HindⅢ）和凝胶电泳、纯化. 纯化后的目的片段与同样处理的载体pET30a+连接，转入DH5a菌，铺LB板（含Amp 20 mg/L）进行抗性筛选，将单菌落进行扩增后抽提质粒、PCR鉴定及测序鉴定. 1.2.2表达条件及产物的亲和纯化将鉴定正确的融合蛋白表达质粒PET30a(+)电转化入工程表达菌BL21 star(DE3)，挑取Kan抗性菌落，扩大培养于含30 mg/L Kan的LB培养基中, 37℃振荡培养至A600 nm为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L诱导表达8 h，14 000 g离心5 min收集菌体，超声破碎细胞包涵体，21 000 g离心20 min. 离心后上清可溶性蛋白经TALON柱芯亲合纯化，沉淀包涵体蛋白经6 mol/L的盐酸胍溶解后经TALON柱芯亲合纯化，将可溶性蛋白及溶解后的包涵体分别以5 mmol/L的咪唑洗涤杂蛋白，然后用150,300,500 mmol/L的咪唑梯度洗脱目的蛋白，少量多次纯化,收集主峰，脱盐、冷冻干燥后得融合蛋白. 1.2.3SDSPAGE、染色按分子克隆第三版进行，用蛋白质银染液染色. 1.2.4Western blot分析以抗6×His单克隆抗体为一抗、HRP羊抗鼠IgG单抗为二抗，并以DAB显色. 1.2.5溶合蛋白的FXa裂解参考文献［7］的方法，将融合蛋白溶于FXa裂解缓冲液中，加入FXa，28℃保温10 h. 1.2.6rLL37多肽的离子交换纯化、分子量测定将FXa裂解后的蛋白以强离子交换柱芯MacroPrep High S进行梯度纯化，条件为：平衡液10 mmol/L NaCl,洗脱ABCD液分别为220，350，500及1000 mmol/L NaCl，收集各洗脱峰，脱盐、低温低压冻干. 以Folin酚法测定蛋白质含量，并进行SDSPAGE初步鉴定rLL37的纯度，依靠蛋白质在电泳中的移动距离与其分子量的对数成反比的关系，测定蛋白质Marker的各个条带的距离，与其分子量的对数建立一元线性方程，通过测定rLL37的电泳移动距离，计算出rLL37的相对分子量（Mr）. 1.2.7用抑菌圈试验测定rLL37多肽杀菌活性参照文献［4-5］的方法,将15 g/L的底层营养琼脂培养基融化后取10 mL倒入无菌平皿中，凝固后取7 g/L的温度为45℃的琼脂培养基12 mL，加入对数生长期的细菌旋涡振荡［终浓度（3~4）×105］，快速覆盖在底层胶上，凝固后在上层琼脂上打孔，把一定浓度的rLL37多肽10 μL滴入孔中, 37℃孵育过夜. 抑菌活力以抑菌圈直径(mm)表示. 同时取生理盐水及Amp，左氧氟沙星等作对照. 2结果 2.1rLL37多肽融合表达质粒的构建改良杀菌肽LL37的DNA序列成功转入表达载体pET30（a+）中（图1）. 抽质粒及PCR鉴定目的片段分子量大小正确（图2），目的DNA序列经公司测序鉴定,证实rLL37基因正确地接入pET30a(+)质粒. 图1构建rLL37多肽融合表达质粒流程图（略） 2．2rLL37多肽的融合表达重组的表达质粒电转化入工程表达菌BL21 star(DE3)中，挑选抗Kan的阳性转化子经IPTG诱导8 h，经浓缩胶40 g/L, 分离胶150 g/L SDSPAGE，蛋白质银染染色，在蛋白质Mr约15×103处可见一条明显条带（图3）. 用凝胶扫描显示重组融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的35％. 重组融合蛋白主要以包涵体蛋白形式存在，少量以可溶性蛋白形式存在. 将可溶性蛋白和溶解后包涵体蛋白过6×His亲和纯化TALON柱心，经150 mmol/L的咪唑洗下一个宽大的B峰，在300 mmol/L的咪唑洗下一个较小的C峰. 图2含目的片段质粒pET30a(+)的鉴定（略） 图3rLL37在大肠杆菌中融合表达SDSPAGE分析（略） 2.3Western blot将6×His TALON亲和纯化收集的B，C峰蛋白脱盐、冻干后进行免疫印迹鉴定，B峰在Mr约15×103处可见一条染浅棕色条带，可证实B峰含有目的LL37片段（图4）. 2．4rLL37多肽的离子交换纯化将6×His TALON亲和纯化收集的B峰用FXa裂解后，经MacroPrep High S强阳离子柱纯化，在350 mmol/LNaCl洗脱峰经SDSPAGE，约在Mr约4000处可见单一的蛋白条带（图5），与rLL37多肽的理论Mr 4013.8相符. 共获得约2.5 mg rLL37，其制备率约为0.7 mg/L. 2.5rLL37多肽的杀菌活性检测用抑菌圈法证实rLL37肽抗生素对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有很好的抑菌力. 测得rLL37对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)的抑菌圈直径18 mm，Amp对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)的抑菌圈直径8 mm，rLL37对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)的抑菌作用明显优于Amp；rLL37对粪肠球菌（ATCC29212）的抑菌作用（抑菌圈直径13 mm）也较左氧氟沙星（抑菌圈直径10 mm）好（图6）. 图4蛋白质免疫印记（略） 图5FXa裂解、纯化后重组rLL37的SDSPAGE分析（略） 3讨论 临床抗生素的广泛大量使用，导致严重的致病菌耐药性问题. 杀菌肽（又称抗菌肽、肽抗生素）为一类广泛存在于许多生物中的内源性杀菌多肽. 其作用特点在于既不容易导致耐药菌株的产生，又具有广谱抗微生物作用，因而具有极高的应用价值. 在肽抗生素的开发研究中,显然人体基因编码的肽抗生素具有更大的优越性. 人体基因编码的肽抗生素为人体正常物质,他的杀菌机制不同于抗生素,产生抵抗性的可能性较小,而且他不含半胱氨酸合成较容易. 目前国内外学者一方面研究人体内LL37多肽的分布范围及其与感染的关系，如皮肤、气管、肠道、鼻泪管等处的LL37含量与感染程度的关系，充分揭示了LL37对人体的保护作用，除了抗菌、拮抗内毒素作用外, 通过激活细胞因子趋化免疫相关细胞等方式来增强机体获得性免疫；另一方面运用氨基酸合成仪制备杀菌肽，并将肽链中的部分氨基酸残基进行替换，以增强LL37多肽的杀菌力和拮抗内毒素的能力［5，9］. 图6rLL37对金黄色葡萄球菌株杀菌实验（略） 现在有许多载体用来在细菌中快速而有效地表达重组蛋白，我们采用含有6×His的特异亲和纯化标志序列的PET融合表达载体，将rLL37基因与6×His融合，并用蛋白质等电点分析软件比较我们的rLL37基因融合表达载体与PET系列，如PET28a(+)，PET30a(+)等重组后的等电点，结果与PET30a(+)重组后的静电荷最小，有利于亲和纯化. 具有抗菌活性的肽抗生素在E.coli中直接表达时面临两个难题:一是肽抗生素对原核细胞(如细菌) 具有抑杀作用,不易于用原核表达系统直接表达,其二,肽抗生素为小分子,表达产物不稳定,产量不高［8］. rLL37采用融合肽形式以大肠杆菌表达，在设计的引导序列中含有凝血因子Xa酶切位点，融合有引导序列的rLL37对大肠杆菌无害，细菌能正常生长和表达目的蛋白质，当以Fxa酶切除N端的引导序列，则rLL37的N端（带正电荷）碱性多肽区暴露，恢复杀菌力；同时在rLL37多肽的N端加上一个负电荷的多肽，使得整个融合肽的电荷由pH 7.4下的9.0降到3.0，利于TALON柱芯亲和纯化，进一步降低rLL37多肽对BL21 star(DE3)表达菌的损害，提高rLL37多肽表达的产量，其中融合蛋白的表达量约占全菌蛋白的35％. 从而使得rLL37以基因工程制备成为可能，为LL37多肽进一步深入研究奠定基础. 【参考文献】 ［1］ Sorensen OE, Follin P, Johnsen AH, et al. Human cathelicidin, hCAP18, is processed to the antimicrobial peptide LL37 by extracellular cleavage with proteinase 3［J］. Blood, 2001,97(12):3951-3959. ［2］ Henzler KA, Martinez GV, Brown MF, et al. Perturbation of the hydrophobic core of lipid bilayers by the human antimicrobial peptide LL37［J］. Biochemistry, 2004,43(26): 8459-8469. ［3］ Bals R, Lang C, Weiner DJ, et al. Rhesus monkey (Macaca mulatta) mucosal antimicrobial peptides are close homologues of human molecules［J］. Clin Diagn Lab Immunol, 2001,8(2):370-375. ［4］ Zhao C, Nguyen T, Boo LM, et al. RL37, an alphahelical antimicrobial peptide of the rhesus monkey［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45(10): 2695-2702. ［5］ Nagaoka I, Hirota S, Niyonsaba F,et al. Augmentation of the lipopolysaccharideneutralizing activities of human cathelicidin CAP18/LL37derived antimicrobial peptides by replacement with hydrophobic and cationic amino acid residues［J］. Clin Diagn Lab Immunol, 2002, 9(5):972-982. ［6］ Nagaoka I, KuwaharaArai K, Tamura H, et al. Augmentation of the bactericidal activities of human cathelicidin CAP18/LL37derived antimicrobial peptides by amino acid substitutions［J］. Inflamm Res, 2005,54(2): 66-73. ［7］ 袁榴娣,窦非,梁玉璞,等. 含有FXa切割位点的抗菌肽X在大肠杆菌中的融合表达［J］ .生物工程学报,2000,16（3）:411-413. ［8］ 饶贤才,金晓琳，胡晓梅,等. 一个承载分子的设计与肽抗生素hPABβ的高效表达［J］.第三军医大学学报,2002,24（4）:389-392. ［9］ Nell MJ, Tjabringa GS, Wafelman AR,et al. Development of novel LL37 derived antimicrobial peptides with LPS and LTA neutralizing and antimicrobial activities for therapeutic application［J］. Peptides, 2005, 27(4):649-660 |
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