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肌瓣包裹自体气管移植体复合BMP诱导软骨再生           ★★★ 【字体：小 大】
肌瓣包裹自体气管移植体复合BMP诱导软骨再生
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-4    
作者：卢强，李小飞，程庆书，王小平，韩勇，王律，汪健，闫小龙

【关键词】  气管/移植
    BMPinduced cartilage regeneration in tracheal autograft with muscular wrapping
　　【Abstract】 AIM: To study the regeneration of cartilage by rhBMP2 in tracheal autograft with muscular wrapping. METHODS:  Fifteen mongrel dogs were randomly and equally divided into 3 autotransplanted groups: group wrapped with muscle (Group A), group wrapped with muscle and implanted with rhBMP2 (Group B) and group with no treatment (Group C). A fivering cervical tracheal segment was harvested as the autograft. The animals were sacrificed at 1, 2, 4, 8 and 10 weeks postoperative. The general conditions of animals, gross and histological character of the specimens and microvessel density were examined and modified CaCo method was used to detect alkaline phosphatase (ALP). RESULTS:  Little regeneration of cartilage was found in Group C while obvious regeneration of cartilage was found in Group A and Group B. Significant difference was found in ALP within 8 weeks after operation between the three groups, with Group B the highest, followed by Group A and then Group C, while no significant difference was found in ALP 8 weeks after operation between the 3 groups. CONCLUSION:  Local use of bone morphogenetic protein (BMP) may upregulate ALP in tracheal cartilage and inhibit the absorption of tracheal cartilage. Muscle wrapping can increase the microvessel density and RhBMP2 helps to maintain tracheals structure.
　　【Keywords】 trachea/transplantation; alkaline phosphatase; bone morphogenetic protein2; muscular wrapping
　　【摘要】 目的：研究BMP复合肌瓣在自体移植中对软骨再生的作用．方法：将15只杂种犬随机等分为3组，均切取颈部5环气管段作为移植段，行自体移植．A组：肌瓣包裹组；B组：肌瓣复合BMP/I型胶原复合物组；C组：空白对照组．术后1，2，4，8及10 wk处死动物取材，观察和比较实验动物存活情况、移植体气管标本的大体和组织学改变，新生微血管密度（MVD）等指标，用改良钙钴法测定软骨组织中碱性磷酸酶（ALP）的分布．结果：A, B组移植体均有不同程度的软骨再生：C组基本无再生；B组最明显．术后8 wk前，ALP染色阳性面积有统计学意义（t=3.269，P<0.05），在术后8 wk以后其差别无统计学意义．结论：BMP可提高移植段软骨的ALP表达，抑制软骨吸收．肌瓣包裹移植段，能够诱导出新生血管，利于软骨再生，二者复合可有效促进软骨再生.
　　【关键词】 气管/移植; 碱性磷酸酶; 骨形态发生蛋白; 肌瓣
　
　　0引言
　　
　　气管移植由于软化及血供等难题无法临床应用．我们前期研究表明：局部应用骨形成蛋白（BMP）可诱导出移植段新生软骨，抑制其吸收［1］，但效果不满意．我们采用肌瓣包裹自体移植段，促进其血液循环及软骨再生，并复合BMP行自体移植研究，同时局部观察碱性磷酸酶（ALP）活性的变化，明确BMP抑制软骨吸收、促进再生，维持气管形态的机制．
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　rhBMP2（第四军医大学基础部生物化学教研室）；I型胶原（华美生物公司）；石蜡切片机（德国Leica公司）；HPIAS1000高清晰度彩色病理图像分析仪（武汉同济医科大学千屏影像工程公司）；ALP测定试剂盒（BGH Bio Co，台湾）．西安地区健康雄性成年杂种犬15只，体质量12.7～14.6 kg．
　　1.2方法
　　1.2.1动物分组将杂种犬随机等分为3组：A组为肌瓣包裹组；B组为肌瓣复合BMP/I型胶原复合物组；C组为空白对照组．均术前晚禁食．
　　1.2.2制备rhBMP2／胶原缓释系统取320 mg胶原冻干品，溶于适量10  mmol/L盐酸溶液，pH值调至5，成黏稠液体．rhBMP2干粉32 mg溶于适量灭菌水，充分搅拌混匀入胶原溶液中．均分成8份，冻干，呈白色海绵状．环氧乙烷消毒，4℃下密封保存．每份含rhBMP2  1 mg，胶原10 mg．
　　1.2.3麻醉及手术速眠新（0.15 mL/kg，im）麻醉．仰卧位固定，气管插管行机械通气．术野备皮，常规消毒、铺单．在环状软骨与胸骨间沿颈正中线作一切口，长约15 cm．分离并显露颈段气管．切取一5环气管段，青霉素生理盐水溶液冲洗，测量管腔横径(a1)及前后径(b1)［2］ ，A组：双侧胸骨舌骨肌胸骨甲状肌联合肌瓣包裹移植段及上下吻合口．B组：同A组肌瓣包裹，每个环间植入BMP/I型胶原溶液1 mL．C组：原位再植．30无损伤缝线对端全层褥式外翻吻合气管，逐层缝合颈部切口．
　　1.2.4rhBMP2／胶原缓释系统植入方法取上述复合物冻干品1份，4 mL灭菌注射用水溶解，呈透明较黏稠液体．吸入5 mL注射器，多点环形分别注射入B组各软骨环间隙内1 mL．即各环间分别植入rhBMP2 1 mg，胶原10 mg．
　　1.2.5术后处理及取材时间所有动物均于术毕立即肌注青霉素8×105 u，相同条件喂养．1，2，4，8及10 wk分别处死各组动物1只．取移植段气管，常规石蜡包埋、切片（厚度5 μm）．
　　1.2.6观察指标①动物存活情况；②大体结构变化；③组织学变化，HE染色、Masson’s三色法染色；④定量组织学测定软骨环间rhBMP2／胶原缓释系统植入区及其两侧的新生软骨区；⑤移植段通畅度：参考Nakanishi等［2］方法计算；⑥软骨积分：半定量测定软骨细胞的存活情况 ，根据公式［3］IS (intensity score)=∑｛［0×F0］+［1×F1］+［2×F2］+［3×F3］｝，F =%×10视野，计算每张切片的染色强度平均值；⑦新生微血管密度（MVD）：按Weidner［4］报道的方法进行计数，取其平均值，换算血管数量，计算平均染色强度；⑧使用ALP测定试剂盒，测量各软骨环间区域，显示ALP的分布．
　　统计学处理：数据用x±s表示，采用SPSS统计软件包处理，组间比较采用方差分析及SNKq检验；组间方差不齐时用非参数秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1动物存活情况B组：全部存活至预杀期．A组：术后5 d因腹泻死亡1只，其余全部存活至预杀期．C组：分别死于术后3，19和27 d．A，B组动物，普遍术后1～2 wk内仅有呼吸道刺激表现，3～4 wk开始出现呼吸困难．4 wk以后，呼吸困难逐渐减轻．
　　2.2大体结构变化A组：移植体软骨有轻度破坏伴部分吸收，管腔略狭窄；B组：移植段与肌瓣粘连紧密；黏膜充血，吻合口愈合良好，气管环大体形态保持良好．C组：移植段气管软化成膜状，偶见增厚；管腔缩窄，腔内明显肉芽增生；软骨环部分断裂、破坏或消失.

2.3组织学改变A组：气管形态保持尚好, 但均伴不同程度的软骨细胞变性、坏死，可见少量新生软骨细胞(Fig 1)．B组：肌瓣两侧rhBMP2植入区可见较多新生软骨细胞(Fig 2)，细胞外软骨基质较丰富, 软骨环间隙为纤维血管组织占据．C组：可见黏膜脱落，软骨坏死溶解吸收及大量肉芽组织增生．个别切片软骨膜外侧偶见新生软骨细胞(Fig 3)．
　　2.4通畅度、软骨积分各组间比较有显著差异（P<0.05）. A，B组通畅度高且软骨保持好；B组软骨保持效果最好(Tab 1).表13组移植段气管的比较（略）
　　2.5MVD定量组织学各组整体有显著性差异（P<0.01）．A，B及B，C组间ALP含量在术后2，4 wk有显著性差异(P<0.05, Tab 2). 肌瓣包裹移植段可以促进血管再生，局部应用BMP可提高软骨细胞ALP含量(Tab 1).表2犬气管软骨碱性磷酸酶染色阳性区域比例表（略）
　　2.6新生软骨面积定量组织学测定各组间比较有显著性差异（P<0.05）. B组新生软骨量最多，C组新生软骨最少(Tab 3).表3新生软骨面积比较（略）
　　3讨论
　　软骨软化吸收是气管移植实验研究的难点．我们前期研究表明：①带蒂大网膜包裹移植段，可促进血供重建；②BMP/I型胶原复合物可诱导软骨生成延缓吸收［5］；③肌瓣包裹可促进血供重建［6］．我们证明：肌瓣在包裹移植体基础上，植入BMP/I型胶原复合物，软骨再生量有明显增加，能较好的维持气管环的大体形态．
　　MVD是衡量血管生成的定量指标，B、C组肌瓣包裹的观察区呈现明显阳性染色的棕黄色，证实了肌瓣包裹可有效促进血供重建．ALP的活性是成骨细胞分化的过程中非常敏感的指标［7］．B组动物2~6 wk气管软骨ALP维持高含量，8 wk后逐渐降低，提示BMP/I型胶原缓释系统释放BMP结束于8 wk前，释放的持续时间较长，可能与复合物注射在软骨环间，周围结缔组织较致密，BMP在组织间扩散受影响有关. 　　实验中B组能较好地促进软骨的再生，较A组再生量明显增加，但与BMP诱导的典型的软骨化骨过程不同，我们并未发现新生软骨能进一步骨化，可能与例数、观察时间，成骨微环境等有关［8］．A组新生血管略显不足，有移植段狭窄的现象．可能因创伤、血管密度低、瘢痕增生、局部的微环境差等［9］，影响了弹性支架的形成．而B组更利于血供重建及软骨形态维持；肌瓣包裹移植段，能诱导出新生血管，BMP则可抑制软骨吸收，提高ALP表达，形成生物弹性支架，动物可存活8 wk以上．
　　自体移植，可除外免疫排斥影响；肌瓣包裹，可诱导出较多新生血管．移植段血供丰富，形态较完整，通畅度高，B组软骨结构保持较好，软化现象明显轻于其他组．而A组通畅度尚可，但固有软骨结构较B组差，维持气管结构的远期效果也差；C组多在术后短期死亡，活过2 wk的2只犬移植段也变性坏死，管腔塌陷，被纤维结缔组织代替. 　　可见,肌瓣包裹既利于血管的再生，又利于保持固有软骨结构，维持气管通畅度．辅以BMP/I型胶原缓释系统，为BMP提供靶细胞间充质细胞，可达良好的生物固定，形成弹性支架，克服软化狭窄性气管塌陷［10］．可为新生血管生长提供时间，为修复气管缺损提供实验基础．
　　【参考文献】
　　［1］ 李小飞，程庆书，刘锟，等.自体气管移植软骨再生的研究［J］.中华实验外科杂志，2003;9:833-834.
　　Li XF, Cheng QS, Liu K, et al. Regeneration of autografted cartilage in dogs tracheal transplantation ［J］. Chin J Exper,2003;9:833-834.
　　［2］ Nakanishi R, Hashimoto M, Yasumoto K. Improved airway healing using basic fibroblast growth factor in a canine tracheal autotransplantation model［J］. Ann Surg, 1998; 227(3): 446-454.
　　［3］ Nakanishi R, Nagaya N, Yoshimatsu T, et al. Optimal dose of basic fibroblast growth factor for longsegment orthotopic tracheal autografts［J］. J Thorac Cardiovasc Surg, 1997; 113(1): 26-36.
　　［4］ Weidner N. Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer ［J］. Am J Pathol, 1995;147(1):9-19.
　［5］ 李小飞，程庆书，王道喜，等.骨形成发生蛋白诱导犬的自体及异体气管移植段软骨再生的比较［J］.第四军医大学学报，2003;24(3):203-205.
Li XF, Cheng QS, Wang DX, et al. A comparative study on cartilage regeneration of dogs auto and       allo transpland trachea induced by bone morphigenetic protein［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24(3):203-205.
　　［6］ 卢强，李小飞，王律，等. 肌瓣对自体及异体气管移植段血液循环建立的促进作用 ［J］.第四军医大学学报，2004;25(23):2127-2129.
　　Lu Q, Li XF, Wang L,  et al. Enhancement of revascularization in orthotopic canine tracheal autografts and allografts with muscular wrapping［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004;25(23):2127-2129.
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　　［9］ Moriyama H, Sasajima T, Hirata S, et al. Revascularization of canine cryopreserved tracheal allografts ［J］. Ann Thorac Surg, 2000;69(6):1701-1706.
　　［10］ 李小飞，张涛，程庆书，等.BMP诱导犬的自体气管移植体软骨再生［J］.第四军医大学学报，2003;24(21): 1960-1962
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