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| 死亡受体5诱导Jurkat细胞凋亡的作用 | |||||
作者：佚名 论文来源：本站原创 点击数： 更新时间：2008-10-4  |
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Role of DR5 in TRAIL induced apoptosis of Jurkat cells 【Abstract】 AIM: To study the role of DR5 in TRAIL apoptotic signal transduction in Jurkat cells. METHODS: cDNA containing fulllength extracellular domain of human DR5 was cloned into pGAPZα. Recombinant Pichia pastoris clone generated via homologous recombination secreted high levels of sDR5. BALB/c mice were immunized with sDR5 in CFA to prepare antiDR5 mAb. The binding of antiDR5 mAb was measured for surface expression of TRAIL receptor by flow cytometric analysis. Jurkat cells were tested for their susceptibility to apoptosis induced by TRAIL with TRAIL apoptosis kit so as to study the correlation between DR5 expression level and TRAIL sensitivity. The level of DR5 expression on Jurkat cell line was examined by flow cytometry. The rates of TRAILinduced apoptosis and antiDR5 mAb blocking on Jurkat cells were tested by flow cytometry with TRAIL apoptosis kit. RESULTS: The killing role of TRAIL was blocked in Jurkat cells pretreated with antiDR5 mAb. The average percentage of blocking was 90.49%. CONCLUSION: AntiDR5 mAb can specifically bind to DR5 and DR5 is expressed at high levels on Jurkat cells. DR5 plays a very key role in TRAIL induced apoptosis in Jurkat cells. DR5 expression is important for the induction of apoptosis by TRAIL. 【Keywords】 Jurkat cells; TRAIL; apoptosis; DR5; antibodies, monoclonal 【摘要】 目的： 探讨DR5在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡中的作用. 方法： 用含人全长DR5细胞外全长结构域重组DR5免疫BALB/c小鼠，制备抗DR5 mAb. 将96孔U型细胞培养板加1×105/孔Jurkat细胞和5 mg/L抗DR5 mAb，采用TRAIL试剂盒检测细胞凋亡率. 结果： 抗DR5 mAb与Jurkat细胞表面的DR5作用后，TRAIL对Jurkat细胞的杀伤功能几乎被抗DR5 mAb完全阻断，阻断率高达90.49%. 结论： DR5在TRAL诱导的Jurkat细胞凋亡中起关键作用. 【关键词】 Jurkat细胞；TRAIL；细胞凋亡；DR5；抗体，单克隆 0引言 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL）是近几年新发现的TNF 超家族成员，TRAIL与其受体结合可以诱导大多数肿瘤细胞凋亡而对大多数正常细胞无影响. 已经发现，TRAIL有5种受体，即2种死亡受体（DR4, DR5）、2种诱骗受体（DcR1, DcR2）及可溶性受体OPG(osteoprotegerin). 其中只有DR4［1］和或DR5有胞内死亡结构域，诱导细胞凋亡. DR4和DR5在诱导细胞凋亡方面具有相同的作用，但哪一种受体在TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡方面更为重要仍不清楚. 发展和应用TRAIL 不同受体的特异性抗体是分析这两种不同受体所参与的死亡途径的关键. 我们用特异性抗DR5 mAb阻断DR5的功能，并应用流式细胞仪检测TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡情况，以探讨DR5在TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡中的作用. 1材料和方法 1.1材料 含有人DR5细胞外结构域全长cDNA的毕赤酵母表达载体菌株由美国宾夕法尼亚大学医学院病理医学实验室陈有海教授馈赠. Jurkat细胞为本室保存细胞株传代培养于含2.0 mmol/L L谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氢钠、10.0 mmol/L HEPES, 1.0 mmol/L丙酮酸钠、100.0 mL/L FBS, 1×105 U/L 青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640培养基. DMEM/HAT和DMEM/HT选择培养基（Sigma公司）. TRAIL凋亡检测试剂盒（Upstate biotech）. FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD公司）. 1.2方法 1.2.1抗DR5 mAb制备及特异性鉴定 1.2.1.1抗DR5 mAb制备参照文献［2］制备抗DR5 mAb. 抗DR5 mAb类型经ELISA法测定mAb的类型分别为IgG1(YM 366, YM 369)和IgM (YM 362, YM 363, YM 367 )，两者均可与sDR5结合，经流式细胞仪分析发现仅IgG能与Jurkat 细胞表面的DR5结合. 1.2.1.2流式细胞仪分析mAb与胞膜DR5结合取生长状态良好的Jurkat细胞，用含 50 g/L BSA 的PBS洗涤3次，计数细胞，取1×105细胞与杂交瘤细胞培养上清100 μL混合，冰浴反应30 min. 预冷PBS洗涤细胞3次，然后每孔加1 μL FITC标记的山羊抗小鼠IgG或IgM（Jackson Immuno Research），冰浴30 min. 预冷PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪进行分析（FACScan, Becton Dickinson）. > 1.2.1.3sDR5对mAb膜结合的阻断作用将10 μL sDR5 (178 mg/L)与100 μL杂交瘤培养上清室温反应30 min，然后与1×105 Jurkat细胞混合，冰浴反应30 min. 预冷PBS洗涤细胞3次，然后每孔加1 μL FITC标记的山羊抗小鼠IgG，冰浴30 min. 预冷PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪进行分析. 1.2.2细胞表面DR5表达水平检测将生长状态良好的Jurkat细胞用含50 g/L BSA PBS洗涤3次，计数细胞，取密度为1×108/L的细胞100 μL，加抗DR5 mAb 1 μg，冰浴反应30 min. 预冷PBS洗涤细胞3次，加PBS 100 μL和FITC标记的羊抗小鼠IgG 1 μL 混合，置冰浴30 min. PBS洗涤3次后用流式细胞仪进行分析. 1.2.3TRAIL诱导细胞凋亡率的检测TRAIL凋亡检测试剂盒检测Jurkat细胞凋亡率，50 μL培养基加至96孔U型细胞培养板，第1孔加50 μL TRAIL,终浓度为100 μg/L，并做倍比稀释. 每孔加50 μL小鼠抗TRAIL mAb IgG1至终浓度为1.5 mg/L,加待测细胞悬液100 μL,细胞终浓度为1×109/L. 37℃, 50 mL/L CO2培养12 h, PBS洗涤3次，每管加PBS 100 μL, PI 10 μL,流式细胞仪检测细胞凋亡率. 1.2.4DR5 mAb对TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡的阻断效应将96孔U型细胞培养板加1×105/孔Jurkat 细胞及5 mg/L抗DR5 mAb，室温反应30 min,按1.2.3方法检测TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡率. 2结果 2.1DR5 mAb与胞膜表面DR5结合特异性检测 2.1.1DR5 mAb与胞膜表面DR5结合率经ELISA分析融合出的5株杂交瘤细胞所有产生的抗DR5 mAb 均能与sDR5结合，mAb类型影响与胞膜受体的结合，只有抗DR5 IgG 类抗体(YM 366, YM 369)能够结合至Jurkat细胞表面（Fig 1）. IgM 类抗体(YM 362, YM 363, YM 367)无法与细胞膜结合. 6A5是不产生DR5 mAb杂交瘤培养上清. 2.1.2sDR5对mAb阻断作用在无sDR5条件下YM 366 mAb的ELISA A450 nm值为1.76,用2.5, 5.0, 7.5, 10.0 μg sDR5中和抗DR5 mAb, A450 nm值分别为1.25, 0.25, 0.22, 0.15,随着sDR5浓度的增加对YM 366的中和作用增强，在高剂量时可以完全阻断mAb的作用，说明YM 366与DR5特异性结合. 2.1.3sDR5对DR5 mAb膜结合阻断结果sDR5能够完全阻断DR5与Jurkat细胞膜的结合（Fig 2）. 说明抗DR5 mAb与细胞膜DR5的结合是特异性的. 实心曲线代表mAb与DR的结合，空心曲线代表sDR5的阻断作用. 2.2DR5在Jurkat细胞表面表达DR5在Jurkat 细胞表面的表达率为94.83%,证明DR5 在Jurkat 细胞表面的高水平表达（Fig 3）. 2.3TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡及抗DR5 mAb的阻断作用TRAIL及抗TRAIL mAb联合应用能够诱导其敏感细胞株Jurkat细胞的凋亡，并呈现明显的剂量相关性. TRAIL浓度在50~100 μg/L时对Jurkat细胞的凋亡率达90%以上. 预先用抗DR5 mAb与Jurkat细胞表面的DR5作用后，TRAIL对Jurkat细胞的杀伤功能几乎完全被mAb所阻断，其平均阻断率达90.49%（Fig 4）. 3讨论 目前，TRAIL与TRAIL受体抗肿瘤的信号传递过程及调节以及正常细胞对TRAIL抗性机制尚未完全清楚［3］. TRAIL能够与两种不同的膜结合受体DR4, DR5、两种诱骗受体DcR1, DcR2及可溶性受体OPG相结合［1］. DR4和DR5均含有传导TRAIL凋亡信号所需要的胞内死亡结构域(death domain, DD)，与TRAIL结合可以引起细胞凋亡，DcR1和DcR2的膜外区有两个与DR4 和DR5高度同源的富含半胱氨酸的伪重复序列，能够与TRAIL结合，但DcR1没有胞内DD，DcR2的胞内区则仅有一段不完整的DD，因此二者都不能传递TRAIL的死亡信号［4,5］. 虽然DR4和DR5在4℃与TRAIL具有相似的结合力，但在37℃ DR5与TRAIL的亲和力最强［6］. 最近发现因各种因素如IFN及许多化疗药物增加细胞对TRAIL凋亡的敏感性也是通过提高DR5的表达实现 ［7-9］，上述结果说明, DR5在TRAIL诱导细胞凋亡方面十分重要，但并不能完全排除DR4的作用， 区别DR4和DR5在介导TRAIL凋亡中的作用及功能比重，对了解TRAIL的抗肿瘤机制、调控及TRAIL的临床应用均十分必要. 在过去的报道中，对DR5的研究主要采用mRNA水平的检测，而mRNA的表达不能完全反映蛋白质的表达水平，对DR5细胞质和细胞膜表达情况也缺乏了解，只有表达于胞膜的DR5才能介导TRAIL凋亡功能. 为了探讨DR5表达与细胞对TRAIL敏感性的关系及进一步探讨TRAIL的功能，我们通过基因工程技术获得DR5高表达工程菌，用sDR5免疫BLAB/c小鼠，融合、筛选出5株抗DR5杂交瘤细胞. 制备2种能与sDR5和胞膜DR5结合并具有封闭TRAIL凋亡的mAb. 用ELISA方法检测发现，抗DR5 IgM和IgG类mAb均可以与sDR5结合，但用流式细胞仪分析发现仅IgG类mAb 能与细胞膜表面的DR5结合. 为确认抗体的特异性，采用ELISA和流式细胞分析发现，sDR5可以阻断抗DR5 mAb与包被到ELISA反应板上的sDR5及Jurkat细胞结合，说明制备的 mAb是DR5特异性，而且IgG类mAb是与胞膜表面DR5表位相结合. 为检测不同浓度sDR5对抗DR5mAb结合Jurkat细胞的抑制效应，我们将YM 366与sDR5混合30 min，然后检测其结合受体的比率. 最低浓度的sDR5仍能抑制YM 366结合Jurkat细胞DR5. 在筛选出的2株 （YM 366和YM 369）mAb 中YM 366的结合能力强. 竞争实验发现YM 366可以有效地与TRAIL竞争性地与DR5结合，从而阻断TRAIL的凋亡作用，说明YM 366能够识别TRAIL与DR5结合的表位. 用YM 366分析发现DR5在Jurkat细胞表面表达为94.83%. 虽然有关TRAIL每一种受体生物学功能及结合时所产生的信号仍不十分清楚，但在此研制的DR5 mAb为受体的研究提供一种十分有价值的工具. 因此，我们制备出能够与DR5特异性结合的mAb,并在TRAIL敏感细胞株Jurkat表面直接检测到DR5的高水平表达. 我们采用TRAIL与抗TRAIL mAb交联诱导Jurkat细胞的凋亡，并呈现明显的剂量相关性,TRAIL浓度在50~100 μg/L 时对Jurkat细胞的杀伤率达90%以上. 预先用抗DR5 mAb与Jurkat作用后，TRAIL对Jurkat细胞的杀伤功能几乎完全被mAb所阻断,其平均阻断率达90.49%. 结果说明，DR5在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡中起着十分关键的作用，并占有绝对的功能比. 由于增加TRAIL的浓度并不能提高Jurkat细胞的凋亡率，说明在TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡方面DR4没有发挥作用. 结果也表明，该mAb是一种有效的DR5阻断抗体，能够和DR5特异性结合，对研究TRAIL的作用机制及调控将会十分有价值. 【参考文献】 ［1］ Pan G, Ni J, Wei YF, et al. An antigonist decoy receptor and death domain containing receptor for TRAIL ［J］. Science, 1997;277(5327):815-818. ［2］ 马远方，杨东亮，陈有海. 抗DR5单克隆抗体在分析TRAIL受体表达中的应用［J］. 中华医学杂志，2003;116(6):947-950. Ma YF, Yang DL, Chen YH. Analysis of TRAIL receptor expression using a novel antiTRAIL death receptor 5 monoclonal antibodies ［J］. Chin Med J, 2003;116（6）: 947-950. ［3］ Jang YJ, Park KS, Chang HY, et al. Analysis of the phenotypes of Jurkat clones with different TRAILsensitivities ［J］. Cancer Lett, 2003；194（1）:107-117. ［4］ Pan G, Ni J, Yu G, et al. TRUNDD, a new member of the TRAIL receptor family that antagonizes TRAIL signalling ［J］. FEBS Lett, 1998;424（1）:41-45. ［5］ Hao C, Beguinot F, Condorelli G, et al. Induction and intracellular regulation of tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand (TRAIL) mediated apotosis in human malignant glioma cells ［J］. Cancer Res, 2001;61（3）:1162-1170. ［6］ Truneh A, Sharma S, Sliverman C, et al. Temperaturesensitive differential affinity of TRAIL for its receptors ［J］. J Biol Chem, 2000;275（30）:23319-23325. ［7］ Wen JH, Ramadevi N, Nguyen D, et al. Antileukemic drugs increase death receptor 5 levels and enhance Apo2Linduced apoptosis of human acute lecukemia cells ［J］. Blood, 2000;96（12）:3900-3906. ［8］ Arts HJ, de Jong S, Hollema H, et al. Chemotherapy induces death receptor 5 in epithelial ovarian carcinoma ［J］. Gynecol Oncol, 2004;92（3）:794-800. ［9］ Higuchi H, Grambihler A, Canbay A. Bile acids upregulate death receptor 5/TRAILreceptor 2 expression via a cJun Nterminal kinasedependent pathway involving Sp1 ［J］. J Biol Chem, 2004;279（1）:51-60 |
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