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高原平原人群基因多态性及低氧相关基因的研究           ★★★ 【字体：小 大】
高原平原人群基因多态性及低氧相关基因的研究
作者：佚名    论文来源：本站原创    点击数：    更新时间：2008-10-4    
作者：余满堂，王晓勤，陈秋红，刘世明，吴天一
【摘要】  目的  本文应用基因检测技术，了解不同群体基因频率、基因型频率及ACE基因特点与低氧调控基因（HIFG）的关系。方法  采用聚合酶链式反应（PCR）基因扩增和聚丙烯酰胺凝胶（PAG）电移及基因序列测定技术，对高原世居藏族、蒙族、汉族和平原世居汉族四个群体血管紧张素转换酶基因（ACE）多态性的研究。结果  测得基因频率为高原汉族0.6562、藏族0.6377、蒙族0.6505和平原汉族0.7186，高原三个群体间差异无显著性，分别与平原比较差异有非常显著性（P＜0.001），基因型频率高原汉族为I/I 14%、I/D 11%、D/D 4%，藏族I/I 16%、I/D 10%、D/D 7%，蒙族I/I 14%、I/D 12%、D/D 6%，平原汉族 I/I 5%、I/D 3%、D/D 26%。显示高原三个群体基因型频率差异较小，这三个群体分别与平原人群比较差异有非常显著性（P＜0.001）。另外，在Wistar鼠HIF基因序列的490bp位点有ACE基因表达。结论  本研究为进一步研究高原人低氧适应的遗传机制提供了分子生物学依据。
    
    【关键词】  藏族；蒙族；汉族；基因多态性；低氧
    
    Study of gene polymorphism and hypoxia related gene on residents livin at high altitude and plain area
    
    【Abstract】  Objective  This paper researched angiotensin converting enzyme（ACE） gene polymorphism of Tibetan，Mongolian，Han Chinese residents living at high altitude and Han Chinese living at plain area.Methods  Applying the technology of polymearse chain reaction（PCR） gene amplification and polyacrylamide gel（PAG） electric charge movement as well as gene sequencing，aims to understand the relationship between ACE gene frequency，ACE gene type frequency and ACE gene character with hypoxia inducible factor gene（HIFG）.Results  Gene frequency is 0.6562，0.6377，0.6505 and 0.7186 in Han Chinese group，Tibetan group，Mongolian group at high altitude and Han Chinese at plain area respectively；there are not significant differences among three high altitude groups，but there is significant difference respectively compare to plain area（P＜0.001）.The gene type frequency is I/I 14%，I/D 11%，D/D 4% in Htan Chinese group at high altitude；I/I 16%，I/D 10%，D/D 7% in Tibetan group，I/I 14%，I/D 12%，D/D 6% in Mongolian group and I/I 5%，I/D 3%，D/D 26% in Han Chinese group at plain area；the result shows that there is minor difference among three high altitude groups，but there is significant difference respectively compare to plain are data（P＜0.001）.In addition，there is gene expression at 490bp point of gene sequence on Wistar rat.Conclusion  This study provides molecular bioloic basis for further studying genetic mechanism of hypoxia adoptation of human beings at high altitude.
    
    【Key words】  Tibetan；mongolian；Han Chinese；gene polymorphism；hypoxia
    
    自然界的生物有多种多样，但每种生物的个体之间又存在着许多差异，一种生物群体尽管在整体水平上有它本身的相同的生物特性，可是在整体某一性状方面存在着个体差异，这种形状的差异科学家称为多态性现象（Polymorphism）。在青藏高原这块特殊的环境中，经过几千年来的繁育，形成了不同适应群体，在这些群体中逐步衍遗了复杂的基因表型的个体［1～3］。笔者应用检测STR基因座的位点多态数据为本底，对照研究ACE基因多态性，了解高原人群ACE基因多态位点变化规律及该基因与低氧的关系，为高原人类低氧适应机制的探讨提供依据。
    
    1  资料与方法
    
    1.1  受试对象  对海拔3550m地区，经体检正常者，选择无血缘关系的世居人群汉族39例，藏族31例，蒙族40例及平原世居汉族35例，分四个试验组，男女不限。
    
    1.2  基因组DNA的制备  对受试个体抗凝外周血样5ml，经盐提法分别提取基因组DNA为世居汉族32份、藏族30份、蒙族29份和平原世居汉族34份，共提取收集DNA样本125份，见表1。
表1  DNA样本的来源
 
    1.3  PCR检测STR基因多态性和ACE基因多态性  人类基因组DNA多态性是由于短串联重复序列（STR）为核心序列的重复次数不同而形成的。根据STR基因座突变率较低，稳定性好，易于标准化，能为人类群体遗传学提供丰富的高信息量遗传标记，以21号染色体中8个基因位点（D21S1432、D21S1435、D21S1270、D21S1440、D21S1446、GATA24H09、ATA42C09、GATA129D11）基因多态检测作本底，按照Hubert等发表的ACE基因结构，对应于ACE基因第16内含子中以ALUT序列设计引物；引物序列：ACE-F，5′-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3′；ACE-R，5′-GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3′。PCR反应体系：25μl体系中，基因组DNA 1.0μl，引物各10pmol，10xpcrbuffer 2.5μl，dNTP 2.5μl，TaqDNA聚合酶0.25u，PCR反应条件：95℃ 5min PCR仪开始循环（预变性）5min，相继94℃变性1min；退火温度55℃ 30s 及72℃ 15min延伸；循环30次（4℃保存）。将PCR产物在2%琼脂糖溴乙啶凝胶上电泳，在紫外灯下观察结果并照相。
    
    1.4  统计学处理  采用Stata计算机软件，计算ACE基因I/I、I/D和D/D多态的基因型频率，确定其符合Hardy-Weinberg平衡，由基因型计算等位基因频率，组间频率用χ2检验。
    
    2  结果
    
    2.1  高原和平原环境四个群体21号染色体STR8个基因座基因多态性结果显示，高原汉族群体基因频率为13.44、藏族群体为21.68、蒙族群体为17.89，平原汉族14.02，高原汉族与平原汉族无群体差异，其他各群体之间差异有显著性。
[NextPage]

 检出的频率在各群体中数据稳定，重复性好，STR8个标记基因座分别在高原汉族、藏族、蒙族和平原汉族人群中出现的等位基因位点杂合度（HET）和基因多态数量（PIG），高原汉族0.6582和0.6693，高原藏族0.7322和0.6897；高原蒙族为0.7750和0.7083；平原汉族为0.6119和0.6709，各群体内部均分布均匀，均表现出各群体特有的高度多态性，分布符合Hardyweinbery平衡定律。检出的等位基因数量最多的为16个，最少的为7个（表），8个位点的累积非它排除率为0.9996，积累的个人识别几率为0.9999（表），符合STR基因座选择标准，因此，这8个基因座在人类群体间个人识别鉴定中有较高实用价值。
    
    2.2  测得ACE基因频率为高原汉族0.6562、藏族0.6377、蒙族0.6505和平原汉族0.7186，高原三个群体与平原比较差异有显著性（P＜0.01），高原三群体间无差异；基因型频率为高原汉族I/I 14%、I/D 11%、D/D 4%，藏族I/I 16%、I/D 10%、D/D 7%，蒙族I/I 14%、I/D 12%、D/D 6%，平原汉族I/I 5%、I/D 3%，D/D 26%。结果显示高原三个群体基因型频率相近，这三个群体分别比平原人群差异有非常显著性（P＜0.01）。另外，在Wistar鼠HIF基因序列的490bp位点有ACE基因表达。
    
    2.3  研究了ACE基因与HIF低氧诱导因子的相关性，在HIF低氧诱导功能区域的基因重复位置进行转基因小鼠基因表达的功能学观察，酶切490bp段基因区域，与对照组比较可见转基因小鼠耳朵血管粗糙、充血等，表达明显，说明ACE基因与低氧下机体调节有关。
    
    3  讨论
    
    3.1  STR八个基因座等位基因分布规律在不同人群中分布符合Hardy-Weinbery平衡定律，其总的个体识别率为高原藏族0.9908，蒙族0.9896，汉族0.9917和平原汉族0.9965，适于群体间个体基因鉴定，属人类高识别能力遗传标记系统。各群体间存在基因频率多态信息量不同，表示群体间存在基因差别，这一研究结果将对人类遗传标记及种族鉴别有较高价值［4～6］；本文首次应用PCR对高原地区进行群体汉族、藏族、蒙族和平原汉族基因多态性统计分析，为高原人群遗传基因资源的利用及进一步研究提供了有意义的科学资料。
    
    3.2  STR基因的八个基因信息数量统计分析，高原不同人群世居汉族11、藏族9、蒙族8，除高原汉族和平原汉族相同外，各民族在统计学上差异有显著性（P＜0.01），目前国内外尚未见到对四个群体的研究报道，对于STR基因在机体遗传信息传导机制还不清楚，笔者认为这一差别是否与群体所处环境有关，尚待研究。
    
    3.3  血管紧张素转换酶基因（ACE）是人类17号染色体第16个内含子中的ALU序列，在190bp和490bp两个位点上有两个不同功能的调节基因，近来较多报道阐述ACE基因在低氧环境下能激活相关酶类，使细胞膜离子通道改变，以达到调节血管紧张素系统的作用［7，8］，有人用酶切方法切去基因功能区域后，观察转基因小鼠的某些生理变化，发现转基因小鼠耳朵血管、皮肤等发生明显改变，这一结果说明：（1）ACE基因490bp位点有功能调节作用。（2）该基因功能在转基因小鼠机体的表达是很强的；（3）说明人与小鼠ACE基因在490bp位点上有同源性，这为低氧基因调控的深层研究提供了重要依据。
    
    3.4  国外研究已标记ACE基因在ALU序列中有190bp和490bp两个插入/缺失位点，笔者将世居高原三个正常群体和世居平原一个群体进行ACE基因PCR扩增，分析比较了高原和平原人群的基因频率和基因型频率，研究结果，高原汉族0.6562和I/I 14%、I/D 11%、D/D 4%；藏族0.5377和I/I 16%、I/D10%、D/D 7%；蒙族0.6505和I/I 14%、I/D 12%、D/D 6%，而平原汉族为0.7186和I/I 5%、I/D 3%、D/D 26%。统计处理结果：高原汉族、藏族和蒙族各频率信号值相近，高原三个群体与平原组差异有显著性，提示ACE基因信息与低氧遗传适应的信号传递可能有关，与国外少数报道［6］一致。
    
    3.5  血管紧张素转换酶（ACE）的活性主要是由ACE基因起调节作用，最新的报道指出，ACE活性可直接对肺动脉胶原代谢有影响，肺动脉ACE活性增强、肺动脉胶原增多与ACE基因活性呈正相关，ACE含量丰富，血管紧张素（AT-11）转化生成率就高；肺动脉ACE活性增高后，AT-11就增高，这时可加强肺血管收缩致动脉压力升高，引起肺动脉胶原堆积增多，当抑制主动脉ACE活性后，抑制主动脉胶原增生并预防高血压的发生［9］，笔者希望能结合临床进一步研究ACE基因在心肌与血管组织基因的表达功能，对阐明ACE基因的低氧、低压调节机制具有重要意义。 
【参考文献】
    1  Hubert C，Houot AM，Corvol P，et al.Strueture of the angiotensin I-converting enzyme gene.J Biol Chem，1991，266（23）：15377.
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    8  郝景华，刘怡雯，周文郁，等.脑卒中患者基因插入/缺失多态性研究.中国神经免疫学和神经病学杂志，1997，4（3）：159-162.
    9  许贻白，王贤军，诸金水，等.血管紧张素Ⅰ转换酶基因多态性与急性脑血管病的关系.中华神经科杂志，1998，31（3）：152-155
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